朱占東， 劉學(xué)鋒，柴守璽*　(.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；.新疆生產(chǎn)兵團(tuán)第十四師一牧場，新疆和田 848306)

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甘肅地區(qū)“平?jīng)?5號(hào)”冬小麥NRX基因的克隆及表達(dá)分析

朱占東1， 劉學(xué)鋒2，柴守璽1*(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.新疆生產(chǎn)兵團(tuán)第十四師一牧場，新疆和田 848306)

硫氧還蛋白(thioredoxin,TRX)作為一類多功能蛋白廣泛存在于植物各種組織器官中，在植物光合作用過程中起重要作用，參與該過程中體內(nèi)活性氧的清除、被氧化蛋白質(zhì)的修復(fù)、電子傳遞等活動(dòng)[1-4]。同時(shí)，TRX基因參與植物抗氧化脅迫過程、抗旱以及耐熱機(jī)制的調(diào)控，同時(shí)還參與調(diào)節(jié)抗逆基因的表達(dá)[5]。Laughner等[6]首次從玉米植株中分離得到核氧還蛋白(nucleoredoxin, NRX)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白為TRX家族新成員，而且該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)包含3個(gè)TRX活性功能區(qū)；夏德習(xí)等[7]研究表明，利用H2O2處理擬南芥后，硫氧還蛋白中的M1型基因((AtTRXm1)表達(dá)量明顯上升，說明該蛋白與氧化脅迫過程有關(guān)。另外，Broin等[8]研究發(fā)現(xiàn)，CDSP32蛋白屬于干旱誘導(dǎo)蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)存在與 TRX蛋白類似的2個(gè)肽序列。因此該蛋白屬于TRX超家族成員，研究表明該蛋白可以緩解由于干旱而引起的氧化脅迫。目前關(guān)于TRX超家族基因所參與的代謝途徑和功能表達(dá)機(jī)理尚不清楚，而且在其他植物種類中也未見該基因的相關(guān)報(bào)道。

2004年甘肅地區(qū)小麥播種面積接近130 萬hm2[9]，其中隴東地區(qū)冬小麥的播種面積和總產(chǎn)值分別占全省的53%和48%[10]。甘肅地區(qū)地形復(fù)雜，常年雨水量偏少、干旱是影響甘肅地區(qū)小麥生產(chǎn)的重要因素[11]，嚴(yán)重威脅著該地區(qū)小麥生產(chǎn)。

筆者以甘肅地區(qū)優(yōu)良雜交種“平?jīng)?5號(hào)”冬小麥為材料，對(duì)TRX家族成員進(jìn)行克隆，并利用生物信息學(xué)手段，分析其相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息，以期為選育優(yōu)良的小麥品種提供依據(jù)，以保障該區(qū)域糧食生產(chǎn)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展和滿足人民生活的供給需求。

1材料與方法

1.1材料“平?jīng)?5號(hào)”冬小麥種子購買于甘肅省平?jīng)鍪修r(nóng)牧局，通風(fēng)干燥條件室溫保存。

EasyTaqPCR SuperMix、dNTPs、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、pMD19-T克隆載體、TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、DNA marker購自全式金生物技術(shù)有限公司(北京)；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)干旱作物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)干旱作物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2方法

1.2.1總RNA提取和cDNA的合成。 將“平?jīng)?5號(hào)”冬小麥的種子經(jīng)除菌處理后，接種在鋪有MS培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，放入光照培養(yǎng)箱中，20 ℃暗培養(yǎng)至苗高15 cm左右，300 μmol/(m2·s)光照培養(yǎng)2 d，采集葉片用Trizol試劑盒(購自TaKaRa公司)提取總RNA，每個(gè)樣品采集3個(gè)重復(fù)。

取小麥葉片，放在含有液氮的研缽中并迅速研磨至粉末狀，然后轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中并立即加入1 ml TRIzol提取總RNA，操作步驟按TRIzol試劑盒說明書進(jìn)行，然后將RNA保存于超低溫冰箱。取小麥總RNA 4 μl通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。20 μl反應(yīng)體系：4 μl 總RNA，TransScript* RT/RI Enzyme Mix 1 μl，2×TS Reaction Mix 10 μl，Anchored Oligo(dT)18 1 μl，然后用無RNA酶水補(bǔ)齊20 μl。該體系反應(yīng)條件按照說明書進(jìn)行。

1.2.2PCR擴(kuò)增。檢索相關(guān)文獻(xiàn)，得到普通小麥TaNRX基因的信息。搜索NCBI得到該基因的核酸序列與蛋白序列信息，根據(jù)核酸序列設(shè)計(jì)引物，結(jié)合Primer 3軟件(http://frodo.wi.mit.edu/)，設(shè)計(jì)引物序列(表1)。

表1　TaNRX家族基因引物序列

以“平?jīng)?5號(hào)”冬小麥葉片材料反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，20 μl反應(yīng)體系：小麥cDNA1 μl， EsTaqMix 10 μl，上游引物和下游引物各0.5 μl， 雙蒸水8 μl；在MG96+型PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。其反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3目的片段回收及克隆。采用EasyPure Quick Gel Extraction Kit(購自全式金)純化回收目的條帶，按照3∶1比例與pMD19-T Vector載體混合，4 ℃孵育過夜；然后利用感受態(tài)細(xì)胞將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)選取12個(gè)大小適中的白色菌落進(jìn)行鑒定并測(cè)序。

1.2.4生物信息學(xué)分析。通過Clustalx軟件比對(duì)分析測(cè)序后的核酸序列，同時(shí)作進(jìn)化樹分析。通過ProtParam軟件在線分析NRX基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；通過TMHMM Server V.2.0在線預(yù)測(cè)NRX基因的跨膜結(jié)構(gòu)；通過SignalP 3.0 Server 軟件預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)的信號(hào)肽序列；同時(shí)，通過SOPMA軟件對(duì)NRX基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.5NRX基因定量表達(dá)檢測(cè)。取“平?jīng)?5號(hào)”冬小麥不同器官，每個(gè)器官設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分別提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行不同器官的定量檢測(cè)。通過FL-3000 Realtime PCR 系統(tǒng)，以小麥延伸因子EF1( elongation factors 1)基因?yàn)閮?nèi)參基因[12]，每個(gè)樣品使用3個(gè)重復(fù)，最后通過2-ΔΔCt法[13]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)。

2結(jié)果與分析

2.1小麥總RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄將新鮮樣品用液氮研磨，隨后用TRIzol提取RNA，經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280為1.92，濃度為753 ng/μl。取4 μl RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。用延伸因子EF1(elongation factors 1)引物進(jìn)行PCR，電泳檢測(cè)條帶清晰，大小合適，證明成功得到小麥cDNA。

2.2Trx家族基因NRX的PCR擴(kuò)增及克隆以“平?jīng)?5號(hào)”小麥葉片cDNA為模板，PCR產(chǎn)物大小在1 500～2 000 bp，與Genbank中搜索的晉麥47號(hào)TaNRX大小相近(圖1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

2.3生物信息學(xué)分析

2.3.1NRX基因核苷酸序列分析將測(cè)序(大連寶生物生物工程有限公司)得到的核酸序列，用ExPASy、EMBL-EBI和DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明克隆得到的目的片段包含起始密碼子ATG和終止密碼子TAG，有完整的ORF開放閱讀框，大小為1 734 bp，編碼577個(gè)氨基酸，具有高度保守的氧化還原活性結(jié)構(gòu)區(qū)(redox active motif)：WCPPC和WCGPC，屬于TRX家族(圖2)。通過多重比對(duì)與聚類分析(圖3、4)發(fā)現(xiàn)，NRX基因的核苷酸序列與大麥同源性為88%，與水稻的同源性為82%，與Genbank中晉麥47的TaNRX-a基因的核酸序列完全相同，表明成功克隆至“平?jīng)?5號(hào)”小麥的NRX基因。

2.3.2NRX編碼蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)。通過ProtParam在線預(yù)測(cè)NRX基因的理化性質(zhì)等。生物信息學(xué)顯示，NRX基因編碼的蛋白分子式為 C5103H08474N1734O2132S400，分子量為14.11 kD，等電點(diǎn)4.95,不穩(wěn)定系數(shù)43.18，通常，蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)在40以下為穩(wěn)定蛋白，因此，“平?jīng)?5號(hào)”冬小麥NRX基因編碼不穩(wěn)定蛋白；氨基酸以Gly(28.6%)、Ala (25.4%)、Cys(23.1%)、Thr(22.9%)為主；脂肪系數(shù)為25.43，疏水性平均數(shù)為0.760，預(yù)測(cè)NRX基因編碼脂溶性蛋白。

2.3.3氨基酸信號(hào)肽預(yù)測(cè)。通過SignalP 3.0 Server在線預(yù)測(cè)NRX基因編碼序列信號(hào)肽。當(dāng)C、Y及S的平均值在0.5以上，同時(shí)3個(gè)值的結(jié)果均為“YES”時(shí)，氨基酸序列中才有可能存在信號(hào)肽。該基因的S平均值為0.89，C與Y平均值都小于0.5，且三值獲得的結(jié)果都是“NO”，預(yù)測(cè)NRX基因編碼的蛋白沒有信號(hào)肽。

2.3.4跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。利用TMHMM Server V.2.0對(duì)NRX基因編碼蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)段預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，NRX基因編碼的蛋白肽鏈都不在細(xì)胞生物膜上，無明顯跨膜區(qū)域。最后分析獲得該基因的功能區(qū)不在生物膜上。

2.3.5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。通過SOPMA軟件對(duì)NRX基因編碼的氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(表2，圖5)，結(jié)果表明，該蛋白由 α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲、延伸鏈構(gòu)成，其中α-螺旋所占的比例最大，為34.32%，結(jié)合氨基酸預(yù)測(cè)結(jié)果，表明“平?jīng)?5號(hào)”冬小麥NRX基因編碼的蛋白不穩(wěn)定。

表2　蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4基因器官表達(dá)分析通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行基因表達(dá)分析，以小麥EF1作為表達(dá)對(duì)照基因，檢測(cè)目的基因在“平?jīng)?5號(hào)”雜交冬小麥4種器官中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，NRX基因在其根、莖、莖尖、葉中均有表達(dá)，其中根和莖中相對(duì)表達(dá)量較高，而在葉中的相對(duì)表達(dá)量偏低(圖6)。

3結(jié)論與討論

植物抗旱是多個(gè)基因表達(dá)及其環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。核氧還蛋白(NRX)最早是Kurooka等[14]在酵母中發(fā)現(xiàn)的，因?yàn)楹卸蚧锘钚灾行腃GPC(Trp-Cys-Gly-Pro-Cys)區(qū)而被認(rèn)定為TRX 超家族成員。 植物的NRX最早在玉米中被發(fā)現(xiàn)[15]，TRX家族成員具有改變植物自交不親和性狀的功能，可以用于改良作物的基因型，近2年在大麥、小花棘豆、甘藍(lán)、鐵皮石斛、甘蔗等植物中研究較多。通過抗逆基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)而研究抗旱、耐熱、抗氧化脅迫的機(jī)制，將有助于改良作物的遺傳性狀[8]。該研究利用雜交種“平?jīng)?5號(hào)”小麥抗旱性較強(qiáng)的特點(diǎn)，從其基因組中克隆出NRX基因，其開放閱讀框?yàn)? 734 bp，編碼577個(gè)氨基酸，包含2個(gè)氧化還原二硫化物活性中心WCGPC和WCPPC。生物信息學(xué)分析表明，“平?jīng)?5號(hào)”冬小麥中該基因編碼不穩(wěn)定、脂溶性蛋白，且無信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，編碼的蛋白質(zhì)為非分泌蛋白，這與晉麥47號(hào)小麥有差異，可能與品種和取材有關(guān)。NRX基因生物信息學(xué)分析為進(jìn)一步研究該基因調(diào)控方式提供了基礎(chǔ)。

通常，TRX分為家族Ⅰ和家族Ⅱ，TRX家族Ⅰ中m、f、h類廣泛存在于高等植物不同器官上。如m和f存在于葉綠體，而h存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[16]。小麥TaNRX基因與抗旱相關(guān)的等位變異包括TaNRX-a和TaNRX-b基因型[17-18]。研究表明，TRX在模式植物擬南芥、煙草、小麥胚芽、楊樹及番茄、大麥種子、馬鈴薯根莖、水稻韌皮部、菠菜葉片中均有不同分布[19-20]。經(jīng)過分析，其結(jié)構(gòu)與在晉麥47號(hào)中發(fā)現(xiàn)的TaNRX-a型特征序列相似[12]。

對(duì)“平?jīng)?5號(hào)”冬小麥4種器官NRX基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，NRX基因在小麥4種器官上均表達(dá)，但NRX基因在小麥不同器官的表達(dá)量具有較大差異，體現(xiàn)出不同器官NRX基因不同的表達(dá)模式，表明在不同器官中NRX基因的調(diào)控方式和機(jī)制存在差異。因此，對(duì)NRX基因的功能研究需要對(duì)不同器官或同一器官不同發(fā)育時(shí)期分別進(jìn)行對(duì)比研究。

該研究對(duì)NRX基因的研究結(jié)果為下一步更深層次地研究NRX基因的功能作用及調(diào)控機(jī)理提供依據(jù)，為甘肅地區(qū)抗旱小麥的研究提供參考，具有十分重要的實(shí)踐意義。

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摘要[目的]探討小麥TaNRX基因與抗旱的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制。[方法]根據(jù)晉麥TaNRX基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，利用RT-PCR法從“平?jīng)?5號(hào)”冬小麥的cDNA中擴(kuò)增出一個(gè)DNA片段，并克隆到pMD19-T載體，測(cè)序后比對(duì)分析。[結(jié)果]該片段具有完整的開放閱讀框，長度為1 734 bp，編碼577個(gè)氨基酸，與Genbank中晉麥的核酸序列具有100%的同源性，氨基酸序列中包含2個(gè)氧化還原二硫化物活性中心WCGPC和WCPPC，屬于TRX家族，同時(shí)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼不穩(wěn)定、非分泌、脂溶性蛋白。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，該基因在“平?jīng)?5號(hào)”冬小麥各器官中均有表達(dá)，但具有不同的表達(dá)模式。[結(jié)論]為進(jìn)一步深入研究TaNRX基因的功能及與其他基因之間的相互關(guān)系提供參考。

關(guān)鍵詞小麥；TaNRX基因；克隆；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Cloning and Expression Analysis ofTaNRXGene of Winter Wheat about Pingliang No. 45 in Gansu Area

ZHU Zhan-dong1, LIU Xue-feng2, CHAI Shou-xi1*(1.College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou, Gansu 730070; 2.The Ist Pasturage Farm, Agricultural Division 14 of Xinjiang Production and Construction Corps, Hetian, Xinjiang 848306)

Abstract[Objective]To study the relationship between TaNRX gene and drought resistance of wheat. [Method] According to Jin wheat TaNRX gene sequence, a pair of specific primers was designed and a DNA fragment was amplified from the Pingliang 45 winter wheat using RT-PCR method, then it was cloned into pMD19-T vector, comparison and analysis was conducted after sequencing. [Result] The fragment has a complete open reading frame, 1 734 bp in length, encoding a protein of 577 amino acids. It has 100% homology with the Genbank nucleic acid sequence in Jin wheat, contains WCGPC and WCPPC. The cloning gene belonged to the TRX family, and the code is not stable, non secretion abd fat soluble protein. The gene was all expressed in different organs of Pingliang No. 45 of winter wheat, but with a different expression pattern by the real-time fluorescence quantitative PCR. [Conclusion] This study provides a reference to further study the relationship or function between TaNRX gene and other genes.

Key wordsWheat; TaNRX gene; Clone; Real time fluorescent quantitation PCR

收稿日期2015-04-30

通訊作者

作者簡介朱占東(1985- )，男，甘肅會(huì)寧人，碩士研究生，研究方向：農(nóng)學(xué)作物。*，教授，博士生導(dǎo)師，從事作物栽培學(xué)研究。

中圖分類號(hào)S 512.1+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2015)18-029-04