謝菲　陳茹陽　趙惠恩

摘要：以蒙菊的葉片為試驗材料，對蒙菊（Chrysanthemum mongolicum） 再生體系建立技術(shù)進行了初步探索。結(jié)果表明，蒙菊葉片愈傷誘導培養(yǎng)以MS+6-BA 2.0 mg/L +2，4-D 0.3 mg/L為最適培養(yǎng)基，出愈率87.50%；愈傷組織分化培養(yǎng)以MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L為最適培養(yǎng)基，分化率為67.50%；生根培養(yǎng)以1/2MS+NAA 0.3 mg/L +蔗糖15 g/L為最適培養(yǎng)基，生根率為92.50%，平均根數(shù)5.33條，移栽成活率77.50%。

關(guān)鍵詞：蒙菊；組織培養(yǎng)；再生體系；葉片；培養(yǎng)基

中圖分類號： S682.1+10.4+3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0076-02

收稿日期：2014-12-18

基金項目：國家自然科學基金（編號：30970207）。

作者簡介：謝菲（1990—），女，碩士研究生，主要從事花卉資源育種研究。E-mail： shelffy02@gmail.com。

通信作者：趙惠恩，博士，副教授，主要從事花卉資源育種研究。E-mail：zhaohuien@bjfu.edu.cn。蒙菊（Chrysanthemum mongolicum）是菊科春黃菊族菊屬多年生草本植物。蒙菊從我國內(nèi)蒙古地區(qū)分布至北極地區(qū)，耐寒性顯著，冬季能耐-40 ℃的低溫。蒙菊生于貧瘠的石質(zhì)山坡和亞高山地帶，海拔1 500～2 500 m[1]，耐旱性較好，可以應(yīng)用于屋頂綠化、荒坡綠化、巖石園綠化等方面。但蒙菊在我國分布區(qū)狹小，較難采集，引種后越夏困難，不易成活。通過建立蒙菊的再生體系可實現(xiàn)大規(guī)模擴繁，保存種質(zhì)資源，提高引種成功率。蒙菊的再生體系研究至今未見報道，因此，系統(tǒng)深入研究其再生能力及獲得再生植株，建立專門針對蒙菊的高效穩(wěn)定的再生體系，可為菊花耐寒基因工程和轉(zhuǎn)基因育種工作提供理論基礎(chǔ)和試驗依據(jù)，將有效推進高等植物抗性生物技術(shù)育種進程。本試驗研究目的在于探究蒙菊在組織培養(yǎng)過程中各因素的作用及相互影響，建立出蒙菊的再生體系，為蒙菊的分子生物學研究、細胞學特性和基因工程中遺傳受體系統(tǒng)的建立奠定理論基礎(chǔ)，同時有利于實現(xiàn)蒙菊組培苗大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)。

1材料與方法

1.1材料

本試驗所用外植體為蒙菊組培無菌苗的葉片。

1.2方法

1.2.1愈傷組織的誘導從生長健壯的蒙菊組培苗上剪取0.5 cm2的葉片（圖1-A），將葉片接入MS培養(yǎng)基中，植物生長調(diào)節(jié)劑選用6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L），2，4-D（0.1、0.2、0.3 mg/L），NAA濃度為0.01 mg/L [2]，采用2因素3水平完全隨機試驗設(shè)計[3]，每個處理重復3次。30 d后觀察愈傷組織形態(tài)（圖1-B），統(tǒng)計葉片的出愈率：出愈率=發(fā)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。

1.2.2愈傷組織分化培養(yǎng)將增殖后的愈傷組織接入分化培養(yǎng)基中，誘導其分化出芽點，形成幼小植株（圖1-C）。試驗采用2因素3水平的完全試驗設(shè)計，植物生長調(diào)節(jié)劑選用6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L），NAA（0.05、0.10、0.20 mg/L）。每個處理接種20個0.5 cm3的愈傷組織，重復3次。在30 d后統(tǒng)計分化率，分化率=已分化的愈傷組織/接種愈傷組織總數(shù)×100%。

1.2.3壯苗由于長期生長在含有植物激素的培養(yǎng)條件下，繼代培養(yǎng)所得到的部分芽苗形態(tài)細弱，營養(yǎng)不足，為了提高組培苗的生根率，需要將這些組培苗進行壯苗培養(yǎng)（圖1-D）。將不足3 cm的芽苗移入MS培養(yǎng)基，含蔗糖35 g/L，培養(yǎng)30 d后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)。

1.2.4生根選擇長約3 cm健壯的組培無根苗接入生根培養(yǎng)基中，含15 g/L蔗糖，6 g/L瓊脂，每個處理接入20個組培苗，重復3次。試驗采用2因素3水平完全試驗設(shè)計，培養(yǎng)基分別設(shè)為MS、1/2MS、1/4MS，NAA分別為0.1、0.2、0.3 mg/L，分別在20 d后觀察生根情況（圖1-E），統(tǒng)計生根率和平均根數(shù)。生根率=生根的芽苗數(shù)/接種芽苗總數(shù)×100%；平均根數(shù)=總的根數(shù)/生根的苗數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和DPS（data processing system）軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、方差分析與多重比較，對百分率等數(shù)據(jù)進行方差分析時，先將數(shù)據(jù)進行反正弦轉(zhuǎn)換。2結(jié)果與分析

2.1葉片愈傷組織的誘導試驗

在蒙菊葉片的初代培養(yǎng)試驗中，接種1周后，葉片開始卷曲，在切口邊緣處產(chǎn)生團狀愈傷組織，隨著時間延長，愈傷組織的體積逐漸增大。從表1可以看出，A8處理MS+6-BA 2.00 mg/L +2，4-D 0.30 mg/L顯著優(yōu)于其他處理，出愈率87.50%，出愈時間較短，產(chǎn)生的愈傷組織為綠色，較致密，表面有小突起。A5處理的出愈率僅次于A8，但產(chǎn)生的愈傷組織顏色較淺，產(chǎn)愈量少。愈傷誘導率較低的是A1處理，出愈率42.50%，產(chǎn)生的愈傷組織呈透明狀，含水量較高，質(zhì)地較疏松，在接下來的試驗中幾乎不能分化。

2.2愈傷組織分化試驗

對蒙菊愈傷分化過程進行觀察，發(fā)現(xiàn)愈傷組織上的突起會逐漸分化成很多綠色的不定芽。由表2可見，B8處理 MS+6-BA 2.00 mg/L+NAA 0.10 mg/L的分化效果最好，分化率為67.50%，愈傷表面有叢生芽形成。分化效果最差的處理為B6，分化率僅為15.00%，愈傷組織褐化嚴重。由此可見，褐化現(xiàn)象的防治對愈傷的增殖和分化有著積極的促進作用。

2.3生根培養(yǎng)

無根苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中1周左右，多數(shù)處理中的蒙菊幼苗開始生根，根系呈輻射狀，有白色、淺綠色、褐色幾種不同類型。從表3可以看出，C6處理1/2MS+NAA 0.30 mg/L顯著優(yōu)于其他處理，生根率為92.50%，平均根數(shù)5.33條，根系健壯，白色，生長速度較快。生根情況較差的為C1處理，生根率為32.5%，根系細弱，呈淺綠色，部分根尖變褐，可能是由于培養(yǎng)基中大量元素濃度較高，對根系發(fā)育產(chǎn)生抑制作用。

在生根培養(yǎng)中觀察到，當NAA濃度過高時，根部愈傷組織較多，形成的根短粗；當NAA濃度較高時，根部愈傷組織不多，形成的根輻射狀，粗細適中，根毛較多；當NAA濃度較低時，愈傷組織較少，形成的根細長，數(shù)量較多，根毛較少。

2.4煉苗與移栽

首先選擇較為健壯、高7 cm左右、根長1～3 cm的組培苗進行馴化。在出瓶之前，將培養(yǎng)容器置于較強光下，打開瓶蓋增加通氣，同時在培養(yǎng)基上加入1層無菌水。在開口3 d后進行組培苗的出瓶移栽。先將試管苗在40 ℃左右的溫水中洗去黏附于組培苗根部的培養(yǎng)基，再放入1% KMnO4 溶液中浸泡5 min，沖洗干凈，栽入經(jīng)過高溫滅菌的基質(zhì)中，基質(zhì)選用1/2珍珠巖+1/2草炭。

將移栽后的苗置于人工氣候箱1周，調(diào)節(jié)濕度保持在70%以上、溫度20 ℃左右，待生長穩(wěn)定后放到陽光下讓其生長[4]。每次移栽30株苗，重復3次試驗，30 d后觀察（圖1-F），統(tǒng)計移栽成活率為87.50%。

在試驗中發(fā)現(xiàn)形成新根的狀態(tài)與煉苗的成活率有著密切的關(guān)系。當根健壯、根毛較多、整體呈白色、長度在1～3 cm、直徑1 mm左右時煉苗成活率最高。而根細長、根數(shù)較多、根毛很少、根末端呈褐色、長度大于3 cm的植株煉苗成活較低。所以，選擇根系最適的幼苗進行煉苗可以提高成活率。

3討論與結(jié)論

研究表明，使用不同種類、不同濃度和不同比例關(guān)系的植物生長調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的生長發(fā)育進程、分化的方向和器官發(fā)生。當細胞分裂素/生長素的比值高時，利于芽的分化；而細胞分裂素/生長素的比值低時，有利于根的形成；當二者比值適中時，則愈傷組織處于旺盛的生長狀態(tài)，沒有器官分化[5]。在蒙菊的愈傷分化培養(yǎng)中采用 MS+NAA 0.20 mg/L+

6-BA 0.50 mg/L處理的培養(yǎng)基有少數(shù)愈傷組織出現(xiàn)先分化出根的現(xiàn)象，可能是由于6-BA/NAA的比值較低，促使根器官先發(fā)生。

本次試驗采用的植物生長調(diào)節(jié)劑有6-BA、NAA、2，4-D 3種。試驗結(jié)果表明，在初代培養(yǎng)中，適當添加6-BA、NAA、2，4-D可以有效促進芽的萌動和愈傷組織的誘導。其中2，4-D對愈傷組織的誘導有著明顯的促進作用，但用量過高會產(chǎn)生毒害作用，使形態(tài)畸變，誘導率降低。在繼代培養(yǎng)中6-BA對不定芽的增殖有較好的促進效果，但在試驗觀察中發(fā)現(xiàn)高濃度的6-BA培養(yǎng)基中長期培養(yǎng)會出現(xiàn)較多玻璃化現(xiàn)象。在生根培養(yǎng)中，NAA的運用有利于植株根系萌動，當NAA濃度較高時，形成的根粗壯，根毛較多；當NAA濃度較低時，形成的根細長、數(shù)量較多、根毛較少。

在本試驗中，出現(xiàn)了葉片誘導時出愈率較高，但愈傷組織增殖系數(shù)不高、分化較少的現(xiàn)象，即使愈傷組織能分化出少量芽，也會因培養(yǎng)時間過長無營養(yǎng)而生長緩慢甚至死掉。分析原因，一方面可能是初代培養(yǎng)使用的激素濃度不當，雖然出愈率較高，但所誘導的愈傷組織大多數(shù)是比較致密的愈傷組織，很少有粗顆粒狀突起，難以增殖分化成芽；另一方面可能是由于植物本身的生理狀態(tài)和遺傳特性等因素造成的愈傷組織生長情況不佳[6]；此外，光照、溫度等培養(yǎng)條件不適宜都可能是造成愈傷組織難分化成芽及分化的芽不易成活的因素。具體的愈傷組織分化成苗較難的原因還有待于進一步深入研究。

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