張春紅，楊帆，杜錫賢，范玉，張歡歡，張春敏，韓長玉

(1山東大學第二醫(yī)院，濟南 250033；2山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院)

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落新婦苷對永生化人角質(zhì)形成細胞HaCaT增殖、凋亡的影響及機制探討

張春紅1，楊帆1，杜錫賢2，范玉2，張歡歡1，張春敏1，韓長玉1

(1山東大學第二醫(yī)院，濟南 250033；2山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院)

摘要：目的觀察土茯苓提取物落新婦苷對永生化人角質(zhì)形成細胞HaCaT增殖、凋亡的影響，并探討其機制。方法收集對數(shù)生長期HaCaT細胞，觀察組分別加入不同濃度落新婦苷、空白對照組加DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，采用MTT法測算細胞增殖抑制率，流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率；收集對數(shù)生長期HaCaT細胞，觀察組分別加入不同濃度落新婦苷+20 ng/mL INF-γ、模型對照組加20 ng/mL INF-γ、空白對照組加DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，采用實時熒光定量PCR法檢測細胞中的核轉(zhuǎn)錄因子κB (NF-κB)p65、骨橋蛋白(OPN)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) mRNA。結果落新婦苷在25、50、100、200、400 μg/mL時，HaCaT細胞增殖抑制率分別為3.06%、26.53%、40.82%、60.20%及61.22%。落新婦苷在50、100、200 μg /mL時，觀察組HaCaT細胞早期凋亡率分別為3.26%、8.24%和15.38%；與空白對照組早期凋亡率(1.33%)比較，P均<0.05。與空白對照組比較，模型對照組NF-κB p65、OPN、VEGF mRNA表達增加(P均<0.01)；與模型對照組比較，觀察組隨落新婦苷濃度增加，NF-κB p65、OPN、VEGF mRNA表達逐漸降低(P均<0.05)。結論土茯苓提取物落新婦苷能抑制HaCaT細胞增殖、誘導細胞凋亡，其機制可能與制抑細胞NF-κB p65、OPN、VEGF mRNA表達有關。

關鍵詞：銀屑病；HaCaT細胞株；核轉(zhuǎn)錄因子κB p65；骨橋蛋白；血管內(nèi)皮生長因子；落新婦苷

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性復發(fā)性皮膚病。研究表明[1～3]，VEGF、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB) p65和骨橋蛋白(OPN)在尋常型銀屑病(PV)患者皮損中高表達，干擾素γ(INF-γ)可促進上述因子的表達。落新婦苷即是從土茯苓中提取的黃酮類化合物。2012年3月～2015年3月，我們以永生化人角質(zhì)形成細胞株HaCaT(以下簡稱HaCaT)為研究對象，觀察落新婦苷對HaCaT細胞增殖、凋亡及VEGF、NF-κB p65和OPN mRNA表達的影響。

1材料與方法

1.1材料HaCaT，由天津醫(yī)科大學總醫(yī)院單士軍博士惠贈；落新婦苷標準品購自上海詩丹德生物科技有限公司(批號11/090721，純度≥98%),將落新婦苷溶入DMSO中，用DMEM稀釋配成1 mg/mL混懸液，0.22 μm濾膜抽濾滅菌，-20 ℃貯存?zhèn)溆?；VEGF、NF-κB p65、OPN及β-actin引物序列，由北京華大基因生物技術有限公司合成；MTT試劑盒和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒均由KeyGEN公司提供；熒光定量PCR試劑由Fermentas公司提供。

1.2細胞培養(yǎng)及傳代將HaCaT置于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37 ℃、100%濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中單層傳代培養(yǎng)，每隔48～72 h更換培養(yǎng)液1次。

1.3細胞增殖抑制率測算采用MTT法。取對數(shù)生長期細胞，配成1×104/mL細胞懸液后接種于96孔培養(yǎng)板(200 μL/孔)，分為6組，每組設5個復孔，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞完全貼壁后加藥；吸棄舊培養(yǎng)基，觀察組換用終濃度分別為25、50、100、200、400 μg/mL落新婦苷的新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時設立空白對照組(加入DMEM培養(yǎng)液)。棄去上清液，用培養(yǎng)液洗3次；每孔加入含MTT 50 μL的培養(yǎng)基，37 ℃再培養(yǎng)4 h；棄上清液，每孔加DMSO 150 μL室溫震蕩10 min，使結晶物充分溶解；1 h后用全自動酶標儀(波長490 nm)測定各孔吸光度值(A值)，重復3次，取平均值，計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率= (A對照-A觀察)/A對照×100%。

1.4細胞凋亡率測算 采用流式細胞儀。取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度為1×106/mL。接種12孔板中，培養(yǎng)24 h；觀察組換用含終濃度分別為50、100、200 μg/mL落新婦苷的新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時設立空白對照組(加入DMEM培養(yǎng)液)。收集貼壁生長的細胞制成單細胞懸液，加入Annexin-V-FITC 和 PI，輕輕混勻后加入細胞；懸浮細胞后避光放置5～15 min，PBS洗1遍；用300 μL PBS重懸細胞，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞早期凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

1.5細胞VEGF、NF-κB p65、OPN mRNA表達檢測采用實時熒光定量PCR法。引物設計[4～6]如下：VEGF上游引物5′-CGCCTGTAATCCCAGCACT-3′，下游引物5′-GCCCGAAGTCATTGAGTA GTC-3′，232 bp；NF-κB p65上游引物5′-CACCACTACATCGT-CCGAGGT-3 ′，下游引物5′-CTCTGCCCCATTTCTCC-CCGT -3 ′，301 bp；OPN上游引物5′-CTCTGAAGAA-ACGGATGACT-3′，下游引物5′-CTGGGATGACCTTGATAGCC-3′，389 bp；內(nèi)參照β-actin上游引物5 ′-ACCAACTGGGACGACAT-3′，下游引物5 ′-CGCTCGGTGA GGATCTTCAT-3′，389 bp。取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度為1×106/mL。取2 mL接種于25 mL細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞長至80%～90%時，觀察組更換為含終濃度分別為50、100、200 μg/mL落新婦苷和20 ng/mL INF-γ[7]的新鮮DMEM培養(yǎng)液，另設空白對照組(加DMEM培養(yǎng)液)和模型對照組(加20 ng/mL INF-γ)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集細胞，采用TRIzol試劑盒提取總RNA。取10 μL RNA溶液，加990 μL DEPC水稀釋，在紫外分光光度計內(nèi)測定RNA溶液在260 nm及280 nm處的光密度(OD)值。OD260/OD280>1.7時標本可用，否則重新提取。經(jīng)M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，并以此為模板行PCR擴增。反應條件：室溫放置10 min，42 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，-20 ℃保存。熒光定量 PCR 反應過程：采用Promega Sybre Green Supermixture 2×體系，以2-ΔΔCT計算目的基因相對表達量。

2結果

2.1落新婦苷對HaCaT細胞增殖的影響當落新婦苷濃度在25、50、100、200、400 μg/mL時，HaCaT細胞增殖抑制率分別為3.06%、26.53%、40.82%、60.20%及61.22%；400 μg/mL的落新婦苷處理細胞后產(chǎn)生輕微的細胞毒性作用，部分細胞死亡。

2.2落新婦苷對HaCaT細胞凋亡的影響觀察組當落新婦苷濃度在50、100、200 μg /mL時，HaCaT細胞早期凋亡率分別為3.26%、8.24%和15.38%。與空白對照組早期凋亡率(1.33%)比較，P均<0.05。

2.3落新婦苷對INF-γ誘導HaCaT細胞VEGF、NF-κB p65、OPN mRNA表達的影響見表1。

表1　各組細胞NF-κB p65、OPN及VEGF mRNA

注：與空白對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；模型對照組比較，cP<0.05，dP<0.01；與50 μg/mL比較，eP<0.05，fP<0.01；與100 μg/mL比較，gP<0.05。

3討論

銀屑病的病因和發(fā)病機制尚不明確，新生血管形成是其重要的病理特征之一。VEGF是一種作用最強、最特異的促血管生成因子，可加重銀屑病皮損處的炎癥反應，促進銀屑病的發(fā)病過程。OPN是存在于細胞外基質(zhì)中的一種磷酸化糖蛋白，參與細胞黏附、凋亡、血管形成、炎癥反應、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種病理過程；其屬于Th1型細胞因子，是免疫細胞募集及啟動Th1型細胞免疫的關鍵細胞因子，能促進Th1型反應，在銀屑病和腫瘤細胞中均有較高表達。NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可調(diào)控多種與炎癥和免疫有關的基因表達。研究表明，NF-κB可以刺激OPN和VEGF的表達，從而促進角質(zhì)形成細胞(KC)過度增殖。

土茯苓具有清熱利濕、解毒、祛風止痛等功效，為治療銀屑病的常用中藥。藥理研究證實，土茯苓具有抗腫瘤[8]、抗凝血[9]、抗菌作用[10，12]及調(diào)節(jié)免疫功能[11]。落新婦苷是土茯苓最主要的單體成分。銀屑病表皮過度增殖的KC可分泌一系列細胞因子和炎性因子，參與本病的免疫學發(fā)生、發(fā)展。INF-γ能明顯誘導NF-κB p65、OPN和VEGF mRNA的分泌，可能與INF-γ作用于HaCaT細胞后，刺激局部炎癥反應，使HaCaT細胞分泌細胞因子或炎癥因子增加有關。VEGF能呈劑量依賴性地促進KC的增殖和KC的遷移而抑制其黏附[12]。本研究顯示，隨著落新婦苷濃度升高，HaCaT細胞NF-κB p65、OPN和VEGF mRNA表達降低。TNF-α、INF-γ能誘導人皮膚KC分泌NF-κB增多，且二氫黃酮類化合物柚皮苷能明顯降低細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、INF-γ誘導的趨化因子的分泌，其作用途徑之一可能是通過NF-κB信號通路來實現(xiàn)[7]。氧化苦參堿可下調(diào)HaCaT細胞NF-κB p65和VEGF表達，且兩者呈正相關[13]。而我們的研究結果表明，落新婦苷能抑制HaCaT細胞增殖、誘導細胞凋亡，其機制可能與抑制細胞NF-κB p65、OPN和VEGF mRNA表達有關。

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Effects of astilbin on cell proliferation and apoptosis of human

keratinocytes HaCaT and the mechanism

ZHAGNChun-hong1, YANG Fan, DU Xi-xian, FAN Yu, ZHANG Huan-huan,

ZHANGChun-min,HANChang-yu

(1TheSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250033,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of astilbin on the cell proliferation and apoptosis of human keratinocyte cell line HaCaT and to investigate the mechanism. MethodsHaCaT cells in the logarithmic phase were selected. The observation group was incubated with different concentrations of astilbin, and the blank control group was cultured with DMEM solution for 24 hours. The proliferation and apoptosis of HaCaT cells were respectively measured by MTT and flow cytometry (FCM). HaCaT cells in the logarithmic phase were selected. The observation group was cultured with different concentrations of astilbin+20 ng/mL INF-γ, the model group was cultured with 20 ng/mL INF-γ and the blank control group was cultured with DMEM solution for 24 hours. Real-time fluorogenetic quantitative PCR (FQ-PCR) was employed to detect the expression of nuclear transcription factor-κB p65 (NF-κB p65), osteopontin (OPN) and vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA.ResultsWhen the concentrations of astilbin were 25, 50, 100, 200, 400 μg/mL, the proliferation inhibition rates of HaCaT cells were 3.06%, 26.53%, 40.82%, 26.53% and 61.22%. When the concentrations of astilbin were 50, 100, 200 μg/mL, the early apoptosis rates of HaCaT cells in the observation group were 3.26%, 8.24% and 3.26%, respectively. Compared with the blank control group (1.33%), significant difference was found in the early apoptosis rate (all P<0.05). Compared with the blank control group, the expression of NF-κB p65, OPN and VEGF mRNA was increased in the model control group (all P<0.01). Compared with the model control group, the expression of NF-κB p65, OPN and VEGF mRNA was gradually decreased with the increased concentrations of astilbin (all P<0.05). ConclusionAstilbin can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of HaCaT cells, whose mechanism may be associated with the inhibition of VEGF, NF-κB p65 and OPN mRNA expression.

Key words:psoriasis HaCat cell line; nuclear transcription factor-κB p65; osteopontin; vascular endothelial growth factor; astilbin

收稿日期：(2015-07-12)

通信作者簡介：張春敏(1963-)，女，博士,主任醫(yī)師，主要研究方向為中西醫(yī)結合治療皮膚病的臨床與基礎。E-mail:zhangch1976@163.com

作者簡介：第一張春紅(1976-)，女，博士,副主任醫(yī)師，主要研究方向為中西醫(yī)結合治療銀屑病的臨床與基礎。E-mail: aliu133@163.com

基金項目：國家自然科學基金青年基金項目(81202700/H2709)；山東省自然基金青年基金項目(ZR2010HQ032)；山東省科技攻關項目(2010G0020231)；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目(2009-164)。

中圖分類號：R758.63

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)46-0020-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.46.007