帥　良，李　靜，韓冬梅，吳振先(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州5064;廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，廣東廣州50640)

龍眼己糖激酶基因的克隆及原核表達(dá)

帥良1，李靜1，韓冬梅2，吳振先1
(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州510642;2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，廣東廣州510640)

摘要:【目的】克隆龍眼Dimocarpus longan己糖激酶(Hexokinase，HXK)基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)分析.【方法】以龍眼總RNA為模板，采用RT-PCR結(jié)合RACE法獲得基因全長(zhǎng)cDNA序列，構(gòu)建pET-32a-DlHXK原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌Escherichia coli Rosetta (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá).【結(jié)果和結(jié)論】成功克隆龍眼己糖激酶基因的cDNA全長(zhǎng)序列，命名為DlHXK，登錄號(hào)為KF776906.1.龍眼DlHXK序列全長(zhǎng)2 101 bp，包括1個(gè)1 488 bp的開(kāi)放閱讀框，預(yù)測(cè)編碼495個(gè)氨基酸;進(jìn)化樹(shù)和相似性分析發(fā)現(xiàn)，該基因與溫州蜜柑Citrus unshiu的相似性最高，達(dá)到了82%;熒光定量表達(dá)分析表明，DlHXK基因隨著果實(shí)的發(fā)育成熟表達(dá)量逐漸上升;經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDSPAGE檢測(cè)，所構(gòu)建的原核表達(dá)載體表達(dá)的融合蛋白與預(yù)期蛋白大小相吻合.由此可見(jiàn)，利用RT-PCR結(jié)合RACE方法成功克隆了龍眼的己糖激酶基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，并在大腸埃希菌Rosetta (DE3)中獲得高效表達(dá).

關(guān)鍵詞:龍眼;己糖激酶;基因克隆;熒光定量PCR;原核表達(dá)

帥良，李靜，韓冬梅，等.龍眼己糖激酶基因的克隆及原核表達(dá)［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36(3) : 91-97.

優(yōu)先出版時(shí)間:2015-04-14

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龍眼Dimocarpus longan屬于無(wú)患子科Sapindaceae龍眼屬，是我國(guó)南方主要的亞熱帶果樹(shù)之一，產(chǎn)區(qū)主要分布在廣東、廣西、福建、海南等省.龍眼果實(shí)屬于糖直接積累型，果實(shí)發(fā)育前期只有極少數(shù)的淀粉積累，果實(shí)發(fā)育后期均以可溶性糖的形式貯藏于液泡中［1］.龍眼果實(shí)成熟時(shí)期假種皮中可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)22%～24%，在龍眼果實(shí)的可溶性固形物中，糖是主要組成成分，因此糖組分及其含量在一定程度上已經(jīng)成為衡量龍眼品種好壞的一個(gè)重要指標(biāo)［2］.大多數(shù)高等植物通過(guò)光合作用在葉片中產(chǎn)生以蔗糖為主的碳水化合物，并通過(guò)韌皮部運(yùn)輸分配到不同的庫(kù)組織中［3］.蔗糖進(jìn)入庫(kù)器官后，在蔗糖合成酶或轉(zhuǎn)化酶作用下分解為果糖和葡萄糖，果糖和葡萄糖均為己糖［4-6］.己糖經(jīng)過(guò)磷酸化后才能進(jìn)入糖酵解途徑，從而為植物的生理活動(dòng)提供能量和中間代謝產(chǎn)物，因而己糖磷酸化對(duì)維持植物的呼吸作用是必不可少的［3］.己糖磷酸化的催化酶統(tǒng)稱(chēng)為己糖激酶(Hexokinase，HXK).HXK是一種雙功能酶，不僅催化己糖磷酸化，而且在糖信號(hào)感受和傳達(dá)方面有很重要的作用，同時(shí)它也是植物體呼吸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一［7］.因此，探明龍眼果實(shí)中HXK的生化性質(zhì)對(duì)其糖信號(hào)調(diào)控機(jī)制和人工調(diào)控龍眼果實(shí)中糖含量，提高龍眼果實(shí)品質(zhì)有非常重要的意義.

自從Minet等［8］通過(guò)功能互補(bǔ)表達(dá)文庫(kù)從擬南芥Arabidopsis thaliana中鑒定出第一個(gè)植物HXK基因.目前GenBank已登錄多種高等植物HXK基因全長(zhǎng)或片段序列.但是關(guān)于無(wú)患子科的HXK基因至今鮮見(jiàn)報(bào)道.本論文以龍眼為研究材料，分離克隆出龍眼果實(shí)HXK基因的cDNA全長(zhǎng)序列，通過(guò)熒光定量技術(shù)分析了該基因在果實(shí)不同發(fā)育期間表達(dá)變化情況，并且構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體，在大腸埃希菌Escherichia coli中進(jìn)行表達(dá)，為深入探索HXK基因在龍眼果實(shí)糖代謝過(guò)程中所起作用奠定基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料為石硤龍眼D.longan cv.Shixia，采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所.

參照韓冬梅等［9］對(duì)龍眼果實(shí)發(fā)育進(jìn)程的研究，分別于花后59、73、87、94、101和110 d摘取不同發(fā)育階段龍眼果實(shí)，其中花后110 d為果實(shí)成熟采收時(shí)期.摘取的果實(shí)立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，去梗，選取發(fā)育正常、外觀(guān)良好的果實(shí)作為試驗(yàn)材料.

采集的假種皮樣品于液氮中速凍，置于－80℃超低溫冰箱中保存.

1.2龍眼果實(shí)總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成

從龍眼各發(fā)育階段假種皮中分別提取總RNA，參照熱硼酸方法［10］，并稍作改動(dòng).使用純度合格且已經(jīng)去除基因組DNA的混合果皮和果肉的RNA為模板，采用TaKaRa cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄酶為Reverse Transcriptase M-MLV，使用Random Primer引物，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行cDNA的合成，產(chǎn)物于－40℃條件下保存?zhèn)溆?

1.3龍眼果糖激酶基因(DlHXK)的克隆

根據(jù)GenBank上登錄的其他物種HXK基因序列，重點(diǎn)關(guān)注亞熱帶果樹(shù)，經(jīng)過(guò)比對(duì)保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)特異引物P1和P2.以龍眼cDNA為模板進(jìn)行片段擴(kuò)增: 94℃5 min; 94℃45 s，55℃45 s，72℃60 s，共30個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min.反應(yīng)產(chǎn)物于10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠回收，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，菌液鑒定后送上海生工生物工程公司測(cè)序.

根據(jù)克隆得到的HXK基因片段序列設(shè)計(jì)3' RACE的P3、P4引物以及5'RACE的P5引物; 3'端的獲得使用TaKaRa 3'-Full RACE Core Set試劑盒，方法按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，5'端的獲得通過(guò)TaKaRa 的Clontech Smart試劑盒，方法按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行.擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收轉(zhuǎn)化后測(cè)序.根據(jù)所得的拼接序列，在起始密碼子處和終止密碼子處設(shè)計(jì)引物P6 和P7，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到全長(zhǎng)序列;引物設(shè)計(jì)、序列分析使用DNAMAN和Primer 5.本試驗(yàn)中使用的引物序列見(jiàn)表1，引物均委托上海捷瑞生物工程有限公司合成.

1.4生物信息學(xué)分析

使用GenBank的BLAST工具進(jìn)行序列檢索;引物設(shè)計(jì)、序列拼接及分析采用DNAMAN 6.0軟件;使用NCBI中的ORF Finder工具尋找基因的開(kāi)放閱讀框(ORF) ;使用ExPASy ProtParam進(jìn)行蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析;使用TMHMM 2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析;亞細(xì)胞定位使用PSORT;使用ClustalX 1.83軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì);使用MEGA 5.0軟件中的Neighbor-Joining法(鄰位相連法，NJ)建樹(shù)，并進(jìn)行編輯和測(cè)試。

表1　引物序列及用途Tab.1 Sequence of primers and their usage

1.5龍眼果糖激酶基因(DlHXK)的表達(dá)

選用DlHXK基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行龍眼果實(shí)RT-PCR分析.20 μL擴(kuò)增體系: cDNA模板1 μL，上游引物P13和下游引物P14各1 μL，反應(yīng)SYBR Green MIX 10 μL(Toyobo)，ddH2O 7 μL.RT-qPCR反應(yīng)程序: 50℃2 min; 95℃10 min; 95℃15 s，60℃25 s，72℃35 s，40個(gè)循環(huán).PCR擴(kuò)增程序之后添加溶解程序，得到溶解曲線(xiàn).內(nèi)參基因擴(kuò)增體系使用引物為P11和P12.

1.6原核表達(dá)載體的構(gòu)建

使用Clontech發(fā)明的In-Fusion技術(shù)，于Clontech網(wǎng)上設(shè)計(jì)帶BamH I (GGATCC)和Sal I (GTCGAC)酶切位點(diǎn)的上下游引物P9和P10，PCR反應(yīng)體系為20 μL: 10×LA Taq PCR buffer 2 μL，引物P9和P10 各1 μL(10 μmol·L－1)，LA-Taq酶0.2 μL，dNTP Mixture 2 μL(2.5 mmol·L－1)，cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL.PCR程序: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃30 s，55℃45 s，72℃1.5 min，30個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物使用12 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).目前條帶經(jīng)切膠、純化、回收，所獲得的片段在In-Fusion HD Enzyme Premix酶的作用下連接到經(jīng)過(guò)BamH I和Sal I雙酶切回收后的pET-32a載體上，50℃條件下連接15 min.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板于含氨芐抗性的LB平板上，37℃條件下培養(yǎng)16 h以上，選取重組質(zhì)粒，通過(guò)PCR、雙酶切篩選陽(yáng)性克隆，并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行正確性驗(yàn)證.將構(gòu)建成功的表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-32a-DlHXK，將測(cè)序完全正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌Rosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，以驗(yàn)證單克隆的正確性.

1.7重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析

選取正確的單克隆細(xì)胞接種到5 mL含50 μg·mL－1氨芐的LB培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，然后將菌液按體積比1∶100的比例加入到5 mL含50 μg·mL－1氨芐的LB培養(yǎng)基中，37℃條件下200 r·min－1振蕩培養(yǎng)，期間不斷測(cè)定D600 nm的變化，至D600 nm為0.5～0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG的終濃度為0.4 mmol·L－1，于誘導(dǎo)表達(dá)后的1、3、5和7 h時(shí)離心收集菌體，－20℃條件下保存菌體.使用未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液作為空白對(duì)照，同時(shí)以pET－32a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌加IPTG和不加IPTG分別誘導(dǎo)3 h后收集菌體作為正對(duì)照.

取10 μL菌體沉淀與等體積的上樣緩沖液混勻，進(jìn)行SDS-PAGE膠的電泳檢測(cè)，凝膠使用R-250染色并脫色至背景清晰.

2　結(jié)果與分析

2.1龍眼果實(shí)總RNA的提取

從植物組織中提取RNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的前提，進(jìn)行下一步試驗(yàn)需要高質(zhì)量的RNA，而純度和完整性是評(píng)價(jià)RNA質(zhì)量品質(zhì)的2個(gè)關(guān)鍵指標(biāo).經(jīng)過(guò)測(cè)定，本試驗(yàn)提取的RNA的D260 nm/D280 nm均在1.8～2.0之間，由圖1A可以確定所提取RNA純度較高，可以進(jìn)行下一步試驗(yàn).

圖1　瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1　 Results of agarose gel electrophoresis

2.2龍眼果實(shí)HXK基因全長(zhǎng)的cDNA克隆

根據(jù)GenBank已有序列設(shè)計(jì)特異性引物P1和P2，以提取的總RNA直接反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增出1條與預(yù)期目標(biāo)片段相符、約1 100 bp的DNA片段，經(jīng)測(cè)序分析為HXK基因片段(圖1B).采用3'RACE方法擴(kuò)增HXK基因的3'端，經(jīng)2輪擴(kuò)增后得到長(zhǎng)度600 bp的DNA片段(圖1C)，采用5'RACE方法擴(kuò)增獲得HXK基因的5'端，產(chǎn)物長(zhǎng)度約1 000 bp(圖1D).最后將所得片段和3'端及5'端進(jìn)行拼接，得到HXK基因的全長(zhǎng)cDNA序列，找到起始密碼子ATG，終止密碼子TGA，并設(shè)計(jì)ORF引物進(jìn)行序列全長(zhǎng)準(zhǔn)確性驗(yàn)證(圖1E).

2.3 DlHXK生物信息學(xué)分析

經(jīng)分析對(duì)比發(fā)現(xiàn)，獲得了HXK基因的全長(zhǎng)，命名為DlHXK，其全長(zhǎng)cDNA序列約2 101 bp，包括1 個(gè)1 488 bp的ORF，1個(gè)長(zhǎng)249 bp的5'非翻譯區(qū)序列和1個(gè)長(zhǎng)361 bp的3'非翻譯區(qū)，后面帶著1個(gè)長(zhǎng)12 bp的poly(A)尾，編碼495個(gè)氨基酸.經(jīng)過(guò)Ex-PASy ProtParam推測(cè)，該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為53 700，等電點(diǎn)為6.20，說(shuō)明該蛋白呈酸性，該蛋白含Leu (L)最多，達(dá)10.1%，不含Sec (U)和Pyl (O).總的帶正電殘基(Arg + Lys)為56，負(fù)電殘基(Asp + Glu)為62，不穩(wěn)定系數(shù)35.02，為穩(wěn)定蛋白，其脂溶指數(shù)為96.15，GRAVY(Grand average of hydropathicity)值為－0.007，屬親水蛋白.經(jīng)TMHMM2.0推測(cè)，該蛋白具有跨膜區(qū)域，是膜蛋白.由此可知，DlHXK是跨膜的親水穩(wěn)定性蛋白.經(jīng)過(guò)PSORT推測(cè)，該蛋白亞細(xì)胞定位在葉綠體中的可能性最大.

直接對(duì)獲得的堿基序列在NCBI網(wǎng)站上BLAST，分析其與其他物種HXK基因的相似性發(fā)現(xiàn)，與甜橙Citrus sinensis(AF196966.1)的相似性達(dá)到了86%，與向日葵Helianthus annuus(DQ835563.2)的相似性達(dá)到了77%，與擬南芥(NM _ 119057.3、AK230265.1、U18754.2、U28214.1、)的相似性達(dá)到76%以上.通過(guò)對(duì)其預(yù)測(cè)編碼的氨基酸序列與其他植物中HXK基因的相似性分析發(fā)現(xiàn)，與溫州蜜柑Citrus unshiu(AAG28503.1)相似性達(dá)到了82%，與甜瓜Cucumis melo(ACJ04704.1)、番茄Lycopersicon esculentum(NP_001234710.1)、枇杷Eriobotrya japonica (ADZ96378.1)、甘藍(lán)Brassica oleracea(AAL60584.1)、煙草Nicotiana tabacum(AAS60195.1)等物種相似性分別達(dá)到了79%、71%、74%、73%、74%.與擬南芥(NP_179576.1)的相似性也達(dá)到了72%.使用ClustalX 1.83軟件將其與其他植物HXK基因編碼的氨基酸序列做相似性比對(duì)(圖2)，HXK蛋白含有核心糖結(jié)合域(Sugar: LGFTFSFP-Q-L/I)，并含有4個(gè)肽段(L 1-4)其中L2是不保守的肽段區(qū)域，2個(gè)磷酸化點(diǎn)(P1，P2)，2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(Con1，Con2)和1個(gè)腺苷酸(Adenosine)［11］.

進(jìn)行相似性進(jìn)化分析后，進(jìn)一步用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3).結(jié)果顯示DlHXK與溫州蜜柑AAG28503.1的相似性最高，這與相似性分析結(jié)果相一致.

2.4龍眼DlHXK基因的表達(dá)分析

運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以龍眼GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，檢測(cè)龍眼果實(shí)發(fā)育期間的DlHXK基因的表達(dá)情況(圖4).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DlHXK基因的表達(dá)量隨著果實(shí)的發(fā)育逐漸增加，在果實(shí)成熟采收時(shí)期達(dá)到表達(dá)的最大值，這與果實(shí)在盛夏采收時(shí)期溫、濕度較高導(dǎo)致的生理活動(dòng)旺盛和呼吸強(qiáng)度較高有一定關(guān)系.

圖2　DlHXK基因與其他植物中HXK基因編碼的氨基酸序列相似性比較Fig.2 The amino acid sequence alignment of DlHXK compared with HXK genes of other species

圖3　DlHXK與其他物種HXK基因編碼的氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 The phylogenetic tree of amino acid sequences based on DlHXK and other species with HXK gene

2.5原核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

原核表達(dá)載體pET-32a的質(zhì)粒使用BamH I和Sal I雙酶切(圖5A)后回收產(chǎn)物片段，使用In-Fusion HD Enzyme Premix與帶有In-Fusion連接片段的Dl-HXK基因的ORF片段連接(圖5B)，獲得原核表達(dá)載體pET-32a-DlHXK，轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中.挑選陽(yáng)性克隆菌株進(jìn)行菌液PCR和測(cè)序鑒定.菌液PCR分析發(fā)現(xiàn)能獲得1條約1 500 bp的條帶(圖5C)，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)與DlHXK基因一致，并且未出現(xiàn)堿基突變及移碼現(xiàn)象，表明pET-32a-DlHXK原核表達(dá)載體構(gòu)建成功.提取質(zhì)粒，將pET-32a-DlHXK質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到Rosetta (DE3)中，進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá).

圖5　PCR擴(kuò)增及pET-32a載體雙酶切電泳圖Fig.5　 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification and pET-32a digested by BamH I and Sal I

2.6原核表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)

重組質(zhì)粒pET-32a-DlHXK轉(zhuǎn)入到Rosetta (DE3)中后，使用0.4 mmol·L－1IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，結(jié)果(圖6)表明，在相對(duì)分子質(zhì)量71 700(含His標(biāo)簽18 000)左右位置有目的蛋白的融合表達(dá)條帶，表達(dá)的融合蛋白分子與理論預(yù)測(cè)值相符，這表明融合蛋白在Rosetta(DE3)中成功表達(dá).未誘導(dǎo)的pET-32a-DlHXK則沒(méi)有在71 700左右出現(xiàn)條帶.不同誘導(dǎo)時(shí)間(1、3、5和7 h)結(jié)果表明，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)融合蛋白的表達(dá)量逐漸增大，但5和7 h表達(dá)量相差不大，由此推測(cè)，經(jīng)過(guò)5 h的誘導(dǎo)，融合蛋白的表達(dá)量可以達(dá)到最大值.

圖6　龍眼DlHXK基因重組蛋白在大腸埃希菌中的表達(dá)Fig.6　 Expression of recombinant pET-32a-DlHXK protein in Rosetta (DE3)

3　討論

自Minet等［8］利用酵母hxk1、hxk2雙突變體，通過(guò)功能互補(bǔ)表達(dá)文庫(kù)從擬南芥中鑒定出植物的第1 個(gè)HXK基因后，現(xiàn)今已證實(shí)HXK基因幾乎存在于所有生物體中［12］，現(xiàn)在GenBank上已經(jīng)有多達(dá)28種高等植物的HXK基因全長(zhǎng)或者片段［7］.然而在無(wú)患子科的龍眼上至今沒(méi)有相關(guān)報(bào)道.本文采用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得了1個(gè)長(zhǎng)度為2 101 bp的龍眼HXK全長(zhǎng)cDNA序列，該序列包括1個(gè)1 488 bp的ORF，249 bp的5'非翻譯區(qū)序列和361 bp的3'非翻譯區(qū)，推測(cè)該基因編碼495個(gè)氨基酸.通過(guò)NCBI比對(duì)和同源進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)該基因與溫州蜜桔(AAG28503.1)的HXK基因具有很高的相似性，達(dá)到了82%，可見(jiàn)本文克隆出了龍眼HXK基因.通過(guò)對(duì)部分植物HXK基因的深入研究發(fā)現(xiàn)，植物HXK基因以多基因家族的形式存在［13］，且不同物種家族成員數(shù)不同，水稻中含有10個(gè)HXK家族成員［14］，擬南芥中含有6個(gè)該家族成員［15］，番茄中含有4個(gè)該家族成員［11］，本研究克隆得到1個(gè)HXK基因，推測(cè)可能是該基因的器官表達(dá)特異、時(shí)空表達(dá)差異、轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平差異等原因造成的.

HXK是一種雙功能酶，不僅催化己糖磷酸化，并且在糖信號(hào)感受和轉(zhuǎn)導(dǎo)方面有很重要的作用［16］，同時(shí)它也是植物體呼吸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一［7］.定量分析表明，DlHXK基因的表達(dá)量隨著龍眼果實(shí)的發(fā)育逐漸增加，在果實(shí)成熟采收時(shí)期達(dá)到表達(dá)的最大值，這與果實(shí)在盛夏采收時(shí)期，由于溫度濕度較高導(dǎo)致的生理活動(dòng)旺盛和呼吸強(qiáng)度較高有一定關(guān)系.馬鳳凰［17］研究發(fā)現(xiàn)，龍眼果實(shí)在發(fā)育過(guò)程中，己糖含量隨著果實(shí)的發(fā)育逐漸增加，與本文己糖激酶表達(dá)活性變化表現(xiàn)出較高的一致性.

原核表達(dá)系統(tǒng)具有易操作、穩(wěn)定性好、產(chǎn)量高、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)［18］，為研究蛋白功能和基因表達(dá)提供了一條高效可行的途徑.本研究將DlHXK基因與原核表達(dá)載體pET－32a重組構(gòu)建為pET－32a－Dl-HXK，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)DlHXK蛋白能夠與載體中的His標(biāo)簽蛋白形成融合蛋白，并且在原核表達(dá)體系中成功表達(dá).pET－32a－DlHXK在Rosetta (DE3)中表達(dá)，獲得了1個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為71 700左右的表達(dá)蛋白，除去pET－32a上自帶的相對(duì)分子質(zhì)量18 000的His標(biāo)簽蛋白，可知DlHXK表達(dá)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大約在53 700左右，與前文經(jīng)過(guò)核苷酸推測(cè)編碼蛋白質(zhì)大小結(jié)果相吻合.因此可知龍眼假種皮中DlHXK基因在大腸埃希菌中能夠成功表達(dá)，為深入研究己糖激酶的功能奠定了基礎(chǔ)，但其可溶性及酶學(xué)特性還有待進(jìn)一步驗(yàn)證.

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【責(zé)任編輯李曉卉】

Cloning and prokaryotic expression of hexokinase gene from Dimocarpus longan

SHUAI Liang1，LI Jing1，HAN Dongmei2，WU Zhenxian1
(1 College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China;
2 Institute of Fruit Tree Research，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China)

Abstract:【Objective】Hexokinase gene (named DlHXK) was cloned from longan，Dimocarpus longan cv.Shixia，fruit.The bioinformatics and prokaryotic expression of DlHXK were analyzed.【Method】Total RNA extracted from longan fruit was used as a template.The full length cDNA of the gene was cloned using a combination of RT-PCR and RACE-PCR.Prokaryotic expression vector pET-32a-DlHXK was constructed and transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) to induce expression.【Result and conclusion】The full length cDNA of DlHXK was cloned and its NCBI GeneBank accession number was KF776906.1，which has 2 101 bp nucleotides including a 1 488 bp ORF.It was predicted to encode 495 amino acids.It had the highest homology with the Citrus unshiu (82%) through the NCBI and evolutionary tree analysis.The results of quantitative RT-PCR showed that DlHXK gene expression increased gradually during the longan fruit maturation.Induced by IPTG and determinated by SDS-PAGE，the inducing expressed recombinant protein from prokaryotic expression vector was consistent with the putative protein of DlHXK.Therefore，the full length of DlHXK has been cloned and its prokaryotic expression vector has been constructed successfully.It was induced to express effectively in E.coli Rosetta (DE3).

Key words:Dimocarpus longan; hexokinase; gene cloning; quantitative RT-PCR; prokaryotic expression

基金項(xiàng)目:國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(荔枝龍眼)資助(CARS-33-14)

作者簡(jiǎn)介:帥良(1986—)，男，博士研究生，E-mail: 107206202@ qq.com;通信作者:吳振先(1971—)，男，教授，博士，E-mail: litchi2008@126.com

收稿日期:2014-03-10

文章編號(hào):1001-411X(2015) 03-0091-07

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類(lèi)號(hào):S667.2