馬紫英，倪　焱，魏要武，聶　健，楊水蓮，昌毓嵩，莫美華(華南農業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642)

野生巨大口蘑1株新菌株ITS鑒定及菌絲培養(yǎng)基優(yōu)化

馬紫英，倪焱，魏要武，聶健，楊水蓮，昌毓嵩，莫美華
(華南農業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642)

摘要:【目的】鑒定1株巨大口蘑Tricholoma giganteum新的野生菌株，并優(yōu)化其菌絲的最適培養(yǎng)基.【方法】以1株野生巨大口蘑為研究對象，采用組織分離法，從野生巨大口蘑子實體中分離純化得到純菌絲，利用分子生物學方法進行鑒定，通過測定菌絲生長速度、菌絲長勢等指標對其進行培養(yǎng)條件研究，并運用均勻設計法對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，采用二次多項式逐步回歸方法對試驗結果進行分析.【結果和結論】該野生菌株經鑒定為巨大口蘑，GeneBank編號為JX193694，命名為SCAU3，其菌絲生長的最適溫度為30～32℃，最適pH為7～8，最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為酵母膏.經均勻設計法優(yōu)化得到最適培養(yǎng)基組合:麥芽糖26 g·L－1，酵母膏2 g·L－1，MgSO42.7 g·L－1，KH2PO41.8 g·L－1，維生素B1 16 mg·L－1，pH7.7.

關鍵詞:巨大口蘑; ITS鑒定;培養(yǎng)基優(yōu)化;均勻設計;溫度; pH

馬紫英，倪焱，魏要武，等.野生巨大口蘑1株新菌株ITS鑒定及菌絲培養(yǎng)基優(yōu)化［J］.華南農業(yè)大學學報，2015，36(3) : 98-103.

優(yōu)先出版時間:2015-04-14

優(yōu)先出版網址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20150414.0932.009.html

Key words: Tricholoma giganteum; ITS identification; optimum culture medium; uniform design; temperature; pH

巨大口蘑Tricholoma giganteum，又名洛巴伊口蘑T.lobayense、大白口蘑T.giganteum，屬于擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、口蘑科、口蘑屬［1］.巨大口蘑屬高溫食用菌［2］，朵型優(yōu)美、口感鮮脆［3］，每年5—10月成群長出，6—8月最多［1］，在國外主要分布于非洲地區(qū)和亞洲的印度、孟加拉、日本等地，國內主要分布于臺灣、福建、廣東、香港、廣西、云南、湖南等地［4］.1992年，卯曉嵐首次在香港中文大學校園內鳳凰木Delonix regia樹旁采到了1株巨大口蘑標本［5］; 1998年郭翠英等［6］在福建省亞熱帶植物研究所院內發(fā)現(xiàn)了1株野生大白口蘑，經研究，選育出了5株優(yōu)質豐產菌株; 1998年，劉月廉等［7］在湛江海洋大學校園內鳳凰木附近也發(fā)現(xiàn)了該菌，經鑒定為洛巴伊口蘑［8］;隨后，在福建三明、湖南吉首、陜西、廣西、廈門等地相繼被采集到［4，9-12］.

巨大口蘑營養(yǎng)豐富，其多糖和粗蛋白質量分數(shù)分別為365.9和115.9 g·kg－1;含有18種氨基酸，其中必需氨基酸為74.4 g·kg－1，占氨基酸總量的40.63%，達到FAO/WHO對理想蛋白質的要求［13］.它還含有豐富的礦質元素，如K、Na、Ca、Mg、Fe、Zn等［14］.巨大口蘑具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、抑制高血壓和艾滋病毒等多種功能［15-18］.此外，它還有抗細菌、真菌［19-22］等作用.

華南農業(yè)大學食品學院應用真菌課題組于2011 年5月在華南農業(yè)大學校園內發(fā)現(xiàn)1株巨大口蘑野生菌，該菌株生長在羊蹄甲Bauhinia purpurea的樹根旁，子實體周圍長著野花生Alysicarpus vaginalis，這與以前報道的巨大口蘑通常生長在甘蔗Saccharum officinarum和鳳凰木附近的土壤中不同.其形態(tài)與我們以前采集到的菌株也不同，單個幼小的子實體像保齡球，成叢后像一朵盛開的菊花.而前面采集到的菌株像繡球.另外，該菌株的發(fā)生期與我們已經報道的菌株相比提前了1個月.因此有必要對其進行ITS鑒定及生物學特性研究，結果發(fā)現(xiàn)其對營養(yǎng)的要求與前面的菌株不一致，于是，進一步利用均勻設計法優(yōu)化了其培養(yǎng)基，研究了其栽培學特性.為其馴化栽培，以及今后的產業(yè)化提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1供試菌株

野生巨大口蘑菌株采自華南農業(yè)大學校園內羊蹄甲樹根旁(圖1)，通過組織分離法分離培養(yǎng)得到純化的菌絲.

圖1　野生巨大口蘑菌株的生長環(huán)境Fig.1 The growing environment of Tricholoma giganteum

1.2 ITS鑒定

利用ITS通用引物ITS4和ITS5對分離的野生巨大口蘑菌種進行ITS鑒定.通用引物ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' ; ITS5: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'.ITS-PCR反應體系: Taq酶0.25 U，10×Buffer 5 μL，dNTP 44 μL，模板DNA 1 μL，ITS4/ITS5各1 μL，反應總體積50 μL，用ddH2O補足.擴增過程: 95℃預變性5 min; 95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán); 72℃補平10 min，終止溫度為4℃.擴增產物送由北京六合華大基因科技股份有限公司測序.

1.3培養(yǎng)基

PDA:馬鈴薯(去皮) 200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL.

培養(yǎng)基Ⅰ:馬鈴薯(去皮) 200 g，葡萄糖20 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL.

培養(yǎng)基Ⅱ:葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL.

1.4試驗方法

1.4.1測定方法取生長期和長勢一致的PDA平板上的菌落，用直徑0.9 cm的打孔器取長在同一直徑內的菌塊，接入相應的培養(yǎng)基中央，恒溫培養(yǎng)，菌絲萌發(fā)后，采用十字交叉法測量菌落直徑，每隔3 d測量1次，記錄菌絲長勢，計算生長速度:

生長速度=菌落直徑/生長時間.

1.4.2溫度篩選試驗試驗采用培養(yǎng)基Ⅰ，分別在22、24、26、28、30、32、34和37℃條件下恒溫培養(yǎng)，每個處理5個重復，觀測不同溫度對菌絲生長的影響.

1.4.3 pH篩選試驗試驗采用培養(yǎng)基Ⅰ，調pH分別為5、6、7、8和9，放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理5個重復，觀測不同pH對菌絲生長的影響.

1.4.4碳源試驗試驗所用的碳源包括葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉，分別用20 g的不同碳源代替培養(yǎng)基Ⅱ中的葡萄糖，以不加碳源的培養(yǎng)基Ⅱ做陰性對照，以培養(yǎng)基Ⅰ做陽性對照，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理5個重復，觀測不同碳源對菌絲生長的影響.

1.4.5氮源試驗試驗所用的氮源包括酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、NaNO3、(NH4)2SO4、尿素，分別用5 g的不同氮源代替培養(yǎng)基Ⅱ中的蛋白胨，以不加氮源的培養(yǎng)基Ⅱ做陰性對照，以培養(yǎng)基Ⅰ做陽性對照，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理5個重復，觀測不同氮源對菌絲生長的影響.

1.4.6均勻設計優(yōu)化最適培養(yǎng)基采用均勻設計法優(yōu)化野生巨大口蘑的培養(yǎng)基配方，在單因素試驗結果的基礎上，選擇麥芽糖、酵母膏、MgSO4、KH2PO4、pH、維生素B1 6個因素作為參試因子，按照6因素7水平的均勻設計表U7(76)進行試驗方案設計.每個處理5個重復.

1.4.7最適培養(yǎng)基驗證試驗將優(yōu)化出的最適培養(yǎng)基配方與優(yōu)化試驗中生長較快的培養(yǎng)基進行驗證試驗，每個處理5個重復，觀測菌絲生長速度.

2　結果與分析

2.1野生巨大口蘑的ITS鑒定結果

利用ITS通用引物對野生巨大口蘑進行PCR擴增(圖2)、測序并提交序列，GeneBank編號為JX193694，對測序結果進行剪切BLAST對比，目標序列與我們之前分離的菌株SCAU1 (JX041888)、SCAU2(JX068526)、Dongguanzhuang (JX068527)及貴州分離的菌株(EU051917)的巨大口蘑有99%的相似性，與印度分離的2個菌株JN006792、jn192443的相似性為98%，與印度其他菌株的相似性均低于94%，與美國分離菌株的AF042591的相似性只有35%，與日本分離的3個菌株的相似性只有33%(圖3)，因此，結合形態(tài)學鑒定可確定分離菌種為巨大口蘑1個新菌株，并命名為SCAU3.

圖2　菌株SCAU3的ITS-PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR products of ITS from SCAU3

圖3　新菌株SCAU3與其他巨大口蘑的進化樹Fig.3　 The phylogenetic tree of strain SCAU3 and Tricholoma giganteum related species

2.2溫度對菌絲生長的影響

溫度對菌絲生長的影響明顯，由表1可以看出，野生巨大口蘑菌絲生長的最適溫度為30～32℃，超過37℃生長極其緩慢，低于22℃幾乎不生長.

2.3 pH對菌絲生長的影響

由表2可以看出，菌絲在pH5～9中均可生長，在中性及中性偏堿條件下生長速度較快，在pH5～9的范圍內菌絲均較濃密，但pH5～8菌絲潔白，pH9菌絲發(fā)黃.野生巨大口蘑生長最適pH為7～8.

表1　培養(yǎng)溫度對野生巨大口蘑菌絲生長的影響Tab.1 Effect of temperature on the mycelial growth of Tricholoma giganteum

表2　培養(yǎng)基pH對野生巨大口蘑菌絲生長的影響Tab.2 Effect of pH on the mycelial growth of Tricholoma giganteum

2.4碳源對菌絲生長的影響

菌絲在不同的碳源培養(yǎng)基中生長速度不同(表3).在蔗糖中生長速度最快，但是菌絲不濃密.在可溶性淀粉中生長速度次之，且菌絲稀疏.在麥芽糖中菌絲最濃密，生長速度也較快.在無碳源對照中，雖然生長范圍較大，但是菌絲非常稀薄、細弱.所以選擇麥芽糖作為野生巨大口蘑生長的最適碳源.

表3　培養(yǎng)基碳源對野生巨大口蘑菌絲生長的影響Tab.3 Effects of carbon sources on the mycelial growth of Tricholoma giganteum

2.5氮源對菌絲生長的影響

菌絲在不同氮源培養(yǎng)基中生長速度不同(表4)，在尿素中不生長，在(NH4)2SO4中僅萌發(fā)出菌絲但是不再生長，在NaNO3中菌絲極稀疏，在牛肉膏和PDA中菌絲生長最快，但是菌絲不濃密，在酵母膏中菌絲生長速度較快，且菌絲濃密潔白.所以選擇酵母膏作為野生巨大口蘑菌絲生長的最適氮源.

表4　培養(yǎng)基氮源對野生巨大口蘑菌絲生長的影響Tab.4 Effects of nitrogen sources on the mycelial growth of Tricholoma giganteum

2.6最適培養(yǎng)基優(yōu)化結果

均勻設計試驗結果如表5，以菌絲生長速度為目標函數(shù)(Y)，用DPSV9.5對數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸分析，所得回歸方程為:

Y =0.101 7 + 1.634 4X1+ 0.004 6X52－0.575 5X1X2－1.699 0X1X4+4.999 1X2X4.

對回歸方程進行檢驗，得到相關系數(shù)R = 0.999 997，由此可見，菌絲生長速度與回歸方程中試驗因素的含量有密切的相關性，其顯著性檢驗值F = 36 450.659 6，顯著水平p = 0.004 0＜008.01，剩余標準差S =0.002 2，調整相關系數(shù)R =0.999 984，回歸方程極顯著，說明方程的可信度高.

方程中各項試驗因子的回歸系數(shù)和t檢驗結果見表6.由表6可知，方程中各個回歸項的顯著水平均小于0.01，這說明麥芽糖、pH、麥芽糖與酵母膏、麥芽糖與KH2PO4、酵母膏與KH2PO4的交互作用對菌絲生長速度影響很大，達到極顯著水平.

2.6.1觀察值和擬合值由表7數(shù)據(jù)顯示:觀察值與擬合值接近，最大擬合誤差絕對值僅為0.001 4，進一步說明了回歸方程的準確性.

表5　均勻設計試驗結果Tab.5 The results of experiment based on uniform design

表6　各回歸項的回歸系數(shù)檢驗Tab.6　 The test results of the regression coefficient of the regression items

2.6.2驗證試驗經數(shù)學模擬，分析得出一個最高指標時各個因素的優(yōu)化組合，將此理論最優(yōu)組合與組間最優(yōu)處理配方7(直觀最優(yōu))進行驗證，以確定野生巨大口蘑菌絲生長的最佳培養(yǎng)基，驗證試驗結果如表8.

通過DPS9.50進行顯著性分析，理論最優(yōu)組合與組間最優(yōu)配方7的菌絲生長速度無顯著性差異.因此，野生巨大口蘑菌絲生長最適培養(yǎng)基為:麥芽糖26 g·L－1，酵母膏2 g·L－1，MgSO42.7 g·L－1，KH2PO41.8 g·L－1，pH7.7，維生素B1 16 mg·L－1.

表7　樣本配方的觀察值、擬合值和擬合誤差Tab.7 The observed value，fitted value and fitted error of the samples

表8　不同培養(yǎng)基對野生巨大口蘑菌絲生長速度的影響Tab.8 Effects of the growth of Tricholoma giganteum in different culture media

3　討論與結論

ITS序列分析在食用菌快速分類鑒定方面有著極大的優(yōu)勢，本試驗通過ITS鑒定及在NCBI中BLAST后，發(fā)現(xiàn)SCAU3與guizhou (基因編號為EU051917.1)以及我們之前分離的3個菌株(基因編號分別為JX041888、JX068526、JX068527)有99%的相似性，與India分離的幾個菌株(基因編號分別為JN006792、jn192443、HM120872、GQ231552、jq957908)的相似性分別為98%、98%、94%、85%、83%，與美國分離菌株AF042591的相似性只有35%，與日本分離的3個菌株的相似性只有33%，顯示出了此菌株與其他菌株的差異性，這說明該菌株為一個新菌株.

本文通過對野生巨大口蘑生長特性研究表明，在供試的葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉中，野生巨大口蘑菌絲生長的最適碳源為麥芽糖，其次是蔗糖;在供試的酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、NaNO3、(NH4)2SO4、尿素中，野生巨大口蘑菌絲生長的最適氮源為酵母膏和牛肉膏，在無機氮中菌絲生長較差;菌絲的最適生長溫度范圍為30～32℃，低于22℃菌絲不生長，高于37℃菌絲生長緩慢;菌絲在pH5～9范圍內均可生長，最適pH為7～8.在以上試驗的基礎上應用均勻設計試驗對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基為:麥芽糖26 g·L－1，酵母膏2 g·L－1，MgSO42.7 g·L－1，KH2PO41.8 g·L－1，pH7.7，維生素B1 16 mg·L－1.

本試驗中最適碳源為麥芽糖和蔗糖，這與上官建舟等［3］的研究結果相同，但與劉鴻高等［23］、劉月廉等［24］的研究結果有所不同，其分別為果糖和蔗糖;本試驗的最適氮源為酵母膏，與其他學者的研究結果相同;最適pH試驗結果差別很大，劉鴻高等［23］的大白口蘑最適pH為4～5，劉月廉等［24］的洛巴伊口蘑最適pH為6.5，上官建舟等［3］的巨大口蘑最適pH為6～7，本研究結果為7～8.由此可以得出巨大口蘑不同菌株的生物學特性是有一定差別的，需要對其進行系統(tǒng)的研究，在生產中應根據(jù)菌株不同選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件.

參考文獻:

［1］黃年來.適合熱帶地區(qū)栽培的珍稀菇:巨大口蘑［J］.食用菌，2001，23(5) : 12-13.

［2］吳建成.水平棚架梨園栽培巨大口蘑技術［J］.中國食用菌，2007，26(4) : 60-60.

［3］上官建舟，林汝楷，吳寶芳.巨大口蘑生物學特性的研究［J］.浙江食用菌，2007，15(1) : 16-21.

［4］盧成英，鐘以舉，張敏.吉首大白口蘑(Tricholoma giganteum)研究［J］.微生物學通報，2001，28(4) : 20-23.

［5］李志生.巨大口蘑及其栽培技術［J］.食用菌，2007 (5) : 59-61.

［6］郭翠英，沈育芬.大白口蘑菌株廈3的分離馴化研究［J］.亞熱帶植物科學，2002，31(1) : 14-16.

［7］劉月廉，譚樹明，溫美英，等.野生洛巴伊口蘑菌株的分離與鑒定［J］.食用菌學報，2001，8(2) : 19-23.

［8］鄭貴朝，張善信，胡事君.高溫型洛巴伊口蘑的菌種選育及栽培技術［J］.食用菌，2005，27(4) : 16-18.

［9］上官建舟，林汝楷，吳寶芳.荊西口蘑的馴化研究［C］/ /中國菌物學會，中國食用菌協(xié)會.首屆全國食用菌中青年專家學術交流會論文集.武漢:中國菌物學會，2006: 40-46.

［10］張文雋，吳亞召，雷萍，等.巨大口蘑Tsw-06栽培試驗初報［J］.食用菌，2011，33(6) : 21-22.

［11］陳麗新，韋仕巖，黃卓忠.溫度、酸堿度和培養(yǎng)基含水量對金福菇Tg-505菌絲生長的影響［J］.西南農業(yè)學報，2012，25(2) : 597-600.

［12］張國廣，鄒金美，鄭琳.一株野生大型真菌的ITS分析及生物學特征研究［J］.云南民族大學學報，2010，19 (6) : 395-399.

［13］王元忠，湯洪敏，虞泓，等.巨大口蘑子實體營養(yǎng)成分分析［J］.食用菌學報，2005，12(2) : 24-26.

［14］李濤，王元忠，劉鴻高.巨大口蘑中微量元素的光譜測定［J］.光譜學與光譜分析，2008，28(2) : 450-452.

［15］MAU J L，LIN H C，SONG S F.Antioxidant properties of several specialty mushrooms［J］.Food Res Int，2002，35 (6) : 519-526.

［16］MIZUNO T，KINOSHITA T，ZHUANG C，et al.Antitumor-active heteroglycans from niohshimeji mushroom，Tricholoma giganteum［J］.Biosci Biotechnol Biochem，1995，59(4) : 568-571.

［17］LIU F，OOI V E C，LIU W K，et al.Immunomodulation and antitumor activity of polysaccharide-protein complex from the culture filtrates of a local edible mushroom，Tricholoma lobayense［J］.Gener Pharmacol: Vasc Syst，1996，27(4) : 621-624.

［18］HYOUNG L D，HO K J，SIK P J，et al.Isolation and characterization of a novel angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide derived from the edible mushroom Tricholoma giganteum［J］.Peptides，2004，25 (4) : 621-627.

［19］LI M，ZHANG G，WANG H，et al.Purification and characterization of a laccase from the edible wild mushroom Tricholoma mongolicum［J］.J Microbiol Biotechn，2010，20(7) : 1069-1076.

［20］張倩勉，莫美華.巨大口蘑揮發(fā)油化學成分及抑菌作用的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2008，24(12) : 1232-1235.

［21］莫美華，張倩勉.巨大口蘑子實體抽提物抑菌活性研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(5) : 151-153.

［22］WANG H X，NG T B.Purification of a novel low-molecular-mass laccase with HIV-1 reverse transcriptase inhibitory activity from the mushroom Tricholoma giganteum［J］.Biochem Bioph Res Co，2004，315(2) : 450-454.

［23］劉鴻高，王元忠，張東艷，等.大白口蘑菌絲的培養(yǎng)優(yōu)化［J］.菌物學報，2011，30(1) : 142-146.

［24］劉月廉，陳愛珠，譚樹明，等.野生洛巴伊口蘑菌株生物學特性的研究(英文)［J］.華中農業(yè)大學學報，2004，23(1) : 36-39.

【責任編輯李曉卉】

Identification of a new strain of Tricholoma giganteum by ITS and optimization of culture medium for mycelium

MA Ziying，NI Yan，WEI Yaowu，NIE Jian，YANG Shuilian，CHANG Yusong，MO Meihua
(College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

Abstract:【Objective】A new wild strain of Tricholoma giganteum was identified and the culture medium of mycelium was optimized.【Method】The pure mycelium of T.giganteum was obtained from the wild fruitbody by the tissue isolation and identified by molecular biological techniques.The culture condition of the mycelium was researched by measuring mycelial growth rate and growth vigor.The optimum growth medium of mycelium was determined by the uniform-design-method.The method of quadratic polynomial step regression analysis was employed for analyzing the experiment results.【Result and conclusion】The wild strain was identified as T.giganteum，named as SCAU3.The accession number of ITS sequence was JX193694 in GeneBank.The results show that the optimum carbon source and nitrogen source for mycelium growth are maltose and yeast extract respectively.The optimum temperature is 30－32℃，and the optimum pH in medium was 7－8.The optimum medium for mycelial growth is maltose 26 g·L－1，yeast extract 2 g·L－1，MgSO42.7 g·L－1，KH2PO41.8 g·L－1，vitamin B1 16 mg·L－1，pH7.7.

基金項目:國家自然科學基金(31272218) ;國家星火計劃項目(2012GA780042，2013GA780040) ;廣東省省部產學研項目(2012B091100302) ;廣東省農業(yè)科技推廣專項(201201138) ;廣州市花都區(qū)科技計劃項目(HD13CXY-010)

作者簡介:馬紫英(1988—)，女，碩士研究生，E-mail: ziying@163.com;通信作者:莫美華(1966—)，女，副教授，博士，E-mail: mindymo@163.com

收稿日期:2014-01-18

文章編號:1001-411X(2015) 03-0098-06

文獻標志碼:A

中圖分類號:S511; S502