楊美英，韓　紅，張婷婷，王春紅，汲　添，于　婷，武志海(吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林長春308; 吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，吉林長春308)

3種蛋白含量大豆生育期內不同部位GS基因家族成員表達量差異及GS活性分析

楊美英1，韓紅1，張婷婷1，王春紅1，汲添1，于婷1，武志海2
(1吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林長春130118; 2吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，吉林長春130118)

摘要:【目的】研究谷氨酰胺合成酶(GS)各基因家族成員在不同蛋白含量大豆生育期間的表達量，認識高蛋白大豆籽粒蛋白質形成的特點.【方法】選擇普通栽培大豆、高蛋白栽培大豆和高蛋白野生大豆為材料，研究了整個生育期間GS基因家族各成員在根、莖、葉和根瘤的表達量差異以及不同類型大豆根、莖和葉谷氨酰胺合成酶活性(GSA)的變化.【結果和結論】結果表明:不同蛋白含量大豆各器官中GS基因家族不同成員的表達量具有明顯的差異.GSβ1在根、莖、葉和根瘤中都能高效表達;葉中GS2表達量顯著升高，超過其他器官和根瘤.GSγ1在根、莖、葉中表達量極低，而根瘤GSγ1的表達量明顯增加.生育期內各器官GSβ1及V3～R3期GS總表達量、葉GS2、根瘤GSγ1都表現(xiàn)為高蛋白類型大豆高于普通栽培大豆，這與不同蛋白含量大豆GSA的變化規(guī)律基本一致.在生育期間高蛋白類型大豆較普通栽培大豆能更有效地調控GS基因家族各成員的表達，獲得GSA是籽粒蛋白質含量較高的生理特點之一.

關鍵詞:高蛋白野生大豆;高蛋白栽培大豆;普通栽培大豆; GS基因;基因表達;谷氨酰胺合成酶活性

楊美英，韓紅，張婷婷，等.3種蛋白含量大豆生育期內不同部位GS基因家族成員表達量差異及GS活性分析［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2015，36(3) : 83-90.

優(yōu)先出版時間:2015-04-14

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谷氨酰胺合成酶(GS，EC 6.3.1.2)催化谷氨酸(Glu)與NH3縮合形成谷氨酰胺(Gln)，是植物氮代謝的關鍵酶.GS與氨的親和力很高，還可以使植株避免氨積累所造成的毒害［1］.高等植物的種子、葉、根和果實等器官中分布著多種GS的同工酶，GS的不同功能由不同的GS同工酶承擔［2］.Ochs等［3］已發(fā)現(xiàn)高等植物GS至少有2種形式，即細胞質GS和質體GS.質體GS主要存在于葉綠體基質中，為綠色組織的主要形式，葉片中質體GS的功能是通過硝酸還原和光呼吸過程來同化氨［4］.細胞質GS主要存在于非光合組織內，為非光合組織的主要形式.細胞質GS的主要功能是同化由其他代謝過程(包括根瘤共生固氮)產(chǎn)生的氨［5-6］.多數(shù)研究者認為細胞質GS是由1個小的基因家族編碼，根據(jù)3'非翻譯區(qū)的序列多樣性，大豆細胞質GS基因可分為α、β和γ 3個種類，每個種類分別由2個成員組成，不同成員的表達有組織和器官的特異性［7］.

目前關于栽培大豆谷氨酰胺合成酶活性(GSA)以及GS基因表達量變化的研究已有很多報道［8-9］，GS在栽培大豆生育期間活性的變化對控制植物生長和產(chǎn)量形成的重要性方面已形成共識［10］.但關于蛋白質含量不同大豆類型間GSA及基因表達量差異的研究報道尚不多見.我們在前期對高蛋白野生大豆與普通栽培大豆的研究中發(fā)現(xiàn)，高蛋白野生大豆初莢期開始各個時期的GSA都明顯高于其他類型大豆［11］.為明確GS各基因家族成員在不同類型大豆蛋白質形成過程中的表達量，進一步認識高蛋白類型大豆籽粒高蛋白形成的生理規(guī)律.本文選擇普通栽培大豆、高蛋白栽培大豆和高蛋白野生大豆3個不同蛋白含量大豆為材料，對整個生育期內GS基因各成員的表達量以及根、莖、葉中GSA的變化進行研究，為提高普通栽培大豆籽粒蛋白質含量的選育工作提供依據(jù).

1　材料與方法

1.1植物材料

本試驗分別選用高蛋白野生大豆、高蛋白栽培大豆、普通栽培大豆(不同蛋白質含量大豆的劃分方法參照文獻［11］)為研究材料，主要性狀如表1所示.

表1　供試大豆的主要性狀Tab.1 Main characteristics of different soybean varieties in the present study

1.2試驗方法

1.2.1試驗設計試驗于2013年3月—2014年1月采用盆栽試驗進行.將取自吉林農(nóng)業(yè)大學試驗田的耕層土壤裝入盆內，每份材料種9盆，栽培大豆每盆播種3粒，野生大豆每盆播種6粒，整個生育期間不施肥料，具體方法同參考文獻［11］.

1.2.2植物葉、莖、根與根瘤樣品的采集分別于幼苗期(V3)、分枝期(V6)、初莢期(R3)、鼓粒期(R6)、成熟期(R8)選擇長勢均勻的3株大豆，于上午進行葉片、根、莖和根瘤采集及指標測定;將采集的部分葉片、莖、根與根瘤用蒸餾水沖洗干凈，快速用液氮處理后置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.3引物設計利用野生大豆GS基因表達序列標簽(EST)數(shù)據(jù)庫，獲取GS基因家族成員序列信息.根據(jù)GS基因家族各成員的3'端非編碼區(qū)(3' UTR)進行qPCR引物設計，如果3'UTR序列長度不夠，則向3'端編碼區(qū)延伸.使用的引物設計軟件為Primer Premier 5.0.qPCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表2.

1.2.4葉片、莖、根和根瘤總RNA的提取、D值測定與cDNA的合成采用Trizol法提取大豆葉片、莖、根和根瘤總RNA.采用752N紫外分光光度計測定D260 nm和D280 nm.選擇D260 nm/D280 nm介于1.7～2.0的樣品，采用Easy ScriptTMFirst-strand cDNA Synthesis Super Mix反轉錄試劑盒合成cDNA.

1.2.5 GS基因家族各組分的qPCR測定通過ABI公司的Step one plus實時定量PCR儀進行擴增反應，反應體系設定20 μL: SYBR Premix ExTaqTMII (2×) 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，dH2O 6.0 μL.PCR反應條件為: 95℃預變性30 s; 95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán);每個反應設置3次重復.通過擴增曲線和熔解曲線，確定引物的特異性.qPCR檢測數(shù)據(jù)的處理參照文獻［13］，采用相對定量的2－ΔΔCt方法進行.以普通栽培大豆根的GS2基因表達量為對照，對GS各基因相對表達量作圖.

1.2.6生理指標的測定GSA測定采用文獻［11］的方法進行;可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍G-250法.

表2　供試PCR引物序列Tab.2 The PCR primers used in the present study

2　結果與分析

2.1不同類型大豆各生育期不同器官及根瘤GS基因家族各成員表達量分析

2.1.1不同蛋白含量大豆根中GS基因家族各成員表達量分析由圖1可知，在整個生育期間，3種蛋白含量不同大豆GS各基因家族各成員都有表達，但GS2和GSγ與其他基因相比較，表達量極低.V3期GSα與GSβ的表達量相差不明顯，但從V6～R8期，GSβ1的表達量明顯高于其他基因.

從根部GS基因家族所有成員總表達量分析，R3期之前，高蛋白栽培大豆高于其他2個類型大豆，高蛋白野生大豆在R3期達到最大，普通栽培大豆各基因總表達量R6期最高，R3期略低于R6期.從GSβ1的表達量分析，高蛋白栽培大豆V6期高達3 000，高蛋白野生大豆在R3期接近2 500，普通栽培大豆最高值出現(xiàn)較晚，R6期的最高值也僅有1 600.3種大豆GSβ1的表達量達到最高值之后都開始下降，成熟期時3種大豆GSβ1的表達量以及基因總表達量都降至最低值，但表現(xiàn)為高蛋白野生大豆＞高蛋白栽培大豆＞普通栽培大豆.

2.1.2不同蛋白含量大豆莖中GS基因家族各成員表達量分析由圖1和圖2比較可知，整個生育時期，大豆莖中GS2的表達量明顯高于同時期根中的表達量，GS1基因家族的各成員均有表達，但仍以GSβ的表達量最高，GS2和GSα其次，GSγ表達量持續(xù)偏低.高蛋白栽培大豆和高蛋白野生大豆各基因的總表達量以及GS2、GSβ和GSα的表達量均在V6期達到最高，隨著生育進程推進表達量逐漸降低.普通栽培大豆GSβ的表達量雖在R6期達到最高，但V6～R6期間，GSβ表達量的值從587增加到686，與其他2類大豆相比增加趨勢不明顯.

2.1.3不同類型大豆葉的GS基因家族各成員表達量分析由圖3可見，整個生育時期，3種蛋白含量不同大豆葉中GSα、GSβ1和GS2基因大量表達，GS2變化尤為明顯.葉中GS2表達量高于其他任何器官和根瘤.R3期之前GS2明顯高于GSβ1，R6期開始降低.從圖3F中明顯看出，高蛋白野生大豆葉中GS2 從V3～R3期一直增加，R3期達到最高值，然后急劇下降.整個生育期間高蛋白野生大豆GS2表達量都明顯高于高蛋白栽培大豆和普通栽培大豆.

圖1　3種蛋白含量大豆各生育期根GS基因家族各成員相對表達量變化Fig.1　 Gene expression analyses of GS gene family members from roots of 3 types of soybean at different growth stages

圖2　3種蛋白含量大豆在不同生育時期莖的GS2和GS1家族各成員相對表達量變化Fig.2　 Gene expression analyses of GS2 and GS1 family members from stems of 3 types of soybean at different growth stages

圖3　3種蛋白含量大豆在不同生育時期葉GS1基因家族各成員和GS2相對表達量變化Fig.3　 Gene expression analyses of GS1 gene family members and GS2 from leaves of 3 types of soybean at different growth stages

3種不同蛋白含量大豆葉片GSβ1和GSα基因的表達量在整個生育期呈現(xiàn)“低－高－低”的變化規(guī)律，R3期出現(xiàn)1個明顯的峰值.GSα基因表達量就類型間比較，變化不明顯.但GSβ1基因的表達量在3種大豆間明顯不同.高蛋白栽培大豆GSβ1的表達量從V6期開始一直高于普通栽培大豆.高蛋白野生大豆GSβ1的表達量除V6期低于高蛋白栽培大豆外，其他時期均高于其他2類型大豆.

2.1.4不同類型大豆根瘤GS基因家族各成員表達量分析由圖4可知，大豆根瘤中GSγ2的表達量較低，在圖4中不能被顯示出來，但其他基因都有不同程度的表達.與其他器官各基因表達量的變化相比，GSγ1表達量的增加最為明顯.3種大豆根瘤GSγ1基因表達量在R3期均出現(xiàn)最大值，而且V3～R3期GSγ1表達量表現(xiàn)為高蛋白野生大豆＞高蛋白栽培大豆＞普通栽培大豆，R3期之后高蛋白栽培大豆GSγ1表達量略高于其他2類.

3種不同蛋白含量大豆根瘤GSβ的表達量在整個生育時期都較高，V3～V6期普通栽培大豆GSβ的表達量略高于其他2個類型大豆.高蛋白野生大豆和高蛋白栽培大豆GSβ1的表達量在R3期達到最大值，普通栽培大豆在R6期達到最高.從R3期開始，GSβ1的表達量都表現(xiàn)為高蛋白野生大豆＞高蛋白栽培大豆＞普通栽培大豆.蛋白含量大豆根瘤中GS2 和GSα也都有表達，但與GSγ1、GSβ相比，表達量仍較小，類型間相差不明顯.

圖4　3種蛋白含量大豆在不同生育時期根瘤的GS2和GS1家族各成員相對表達量變化Fig.4　 Gene expression analyses of GS2 and GS1 family members from nodules of 3 types of soybean at different growth stages

2.2不同蛋白含量大豆不同生育期根、莖、葉GSA的變化

從圖5可知，普通栽培大豆、高蛋白野生大豆和高蛋白栽培大豆在整個生育期內，根、莖和葉GSA都呈現(xiàn)單峰曲線的變化規(guī)律，R3期達到最高值.同一類型大豆，各器官GSA都表現(xiàn)為根＞莖＞葉.同一器官不同類型大豆相比較，R3期之前高蛋白栽培大豆GSA較高，R3期之后高蛋白野生大豆根、莖、葉各器官的GSA都要高于其他2類型大豆，這與我們前期的研究結果相一致［11］.而且高蛋白野生大豆V6～R3期增長明顯，R3期之后下降較緩慢.

圖5　3種類型大豆各生育期根、莖、葉谷氨酰胺合成酶活性(GSA)的變化Fig.5　 Glutamine synthetase activaty (GSA) variation in root，stem and leaf at different growth stages of 3 types of soybean

3　討論與結論

GS是高等植物氮素代謝的關鍵酶［14］.根系從土壤中吸收的NO3－，通過莖、葉柄運往葉片，在硝酸還原酶等的作用下轉化為氨態(tài)氮，再經(jīng)GS的作用轉化為谷氨酰胺，進入氮代謝.在ATP供能的情況下，它催化NH4+同化成谷氨酰胺.后者又在谷氨酸合酶(GOGAT)的催化下，將其酰胺轉移到α－酮戊二酸上，從而生成2分子的谷氨酸.生物化學及遺傳學研究表明，GS和GOGAT構成的循環(huán)反應是正常條件下高等植物氨同化的主要途徑［15］.大豆不同生育時期以及不同器官的GS基因家族各成員表現(xiàn)出特異的表達模式和調控方式.Bernard等［16］研究表明植物GS基因的表達受外界環(huán)境的影響，是環(huán)境因子調節(jié)植物氮素積累和利用的重要分子靶點.本試驗利用盆栽的方式對全生育期3種不同蛋白含量大豆根、莖、葉和根瘤的GS2和GS1各基因家族成員表達量進行研究，結果發(fā)現(xiàn)同一基因在不同的器官及根瘤中表達量明顯不同.GSβ1和GSβ2在各時期的根、莖、葉和根瘤中都有表達，但GSβ1的表達在各器官及根瘤中都占有絕對優(yōu)勢，根瘤GSβ2的表達略有增加.這與Morey等［7］和王曉波等［17］發(fā)現(xiàn)GSβ以根和成熟根瘤表達為主的結論有一定差異.本研究中葉GS2表達量超過其他任何基因的表達而達到最大.其他任何時期各器官GSγ1表達量與其他基因相比都極低，根瘤中GSγ1大量表達，這與Swarup等［18］和Bennett等［19］發(fā)現(xiàn)GSγ1表現(xiàn)為根瘤特異表達，GSγ在植物的莖、葉柄和正在發(fā)芽種子的子葉中能低水平表達的結果基本一致.許多研究表明，GSα基因主要在子葉、干種子胚軸、發(fā)芽2 d豆芽、維管組織幼根表達，根瘤中也有少量表達［18，20］.本試驗發(fā)現(xiàn)根、莖、葉和根瘤中GSα從V3～R8期都有表達，但與GSβ相比較，表達量較低.

本試驗發(fā)現(xiàn)不同類型大豆GS基因家族各成員的表達也存在明顯差異.GSβ1在各器官及根瘤都是主要的GS表達者，在較多的生長時期都表現(xiàn)出高蛋白大豆類型＞普通栽培大豆的特點.葉片中GS2表達量和根瘤中GSγ1表達量明顯上升，而且在V3～R3期間也出現(xiàn)高蛋白野生大豆＞高蛋白栽培大豆＞普通栽培大豆的規(guī)律.對不同類型大豆基因總表達量的比較分析也得出同樣的規(guī)律，高蛋白野生大豆和高蛋白栽培大豆都要略高于普通栽培大豆，葉和根瘤表現(xiàn)明顯.說明在整個生育期間，高蛋白類型大豆較普通栽培大豆能更有效地上調GS基因家族各成員的表達.

許多研究者認為GS1的調控主要發(fā)生在轉錄水平［21］.但酶活性受品種自身遺傳特性及光照、氮素形態(tài)、溫度等環(huán)境因素的影響，栽培管理措施和生態(tài)環(huán)境條件亦具有十分重要的作用［22-24］.在特定環(huán)境條件下，GS基因家族各成員轉錄活性與酶分子的組裝之間存在近乎完美的協(xié)調關系，酶分子的利用率才是酶活性高低的先決條件［25］.分析不同蛋白含量大豆的GSA發(fā)現(xiàn)，R3期之后，各類型大豆根、莖、葉的

GSA都表現(xiàn)為高蛋白野生大豆＞高蛋白栽培大豆＞普通栽培大豆的規(guī)律.這說明高蛋白類型大豆在R3期之后GSA高，同化氨較多，促進了GS基因家族各成員的表達.同時，各基因的高表達又有利于形成更多的酶分子，增加GSA.因此，在整個生育期內，高蛋白類型大豆較普通栽培大豆能有效地調控GS基因家族各成員的表達，獲得高GSA是籽粒蛋白質含量較高的生理特點之一.這一規(guī)律可能有助于增加體內可供貯存與運輸?shù)挠袡C氮總量，為高蛋白類型大豆籽粒蛋白質的合成提供充足的原料.

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【責任編輯柴焰】

Differences of GS gene family members expression and analyses of GS activation in different parts of three types of soybean at whole growth stage

YANG Meiying1，HAN Hong1，ZHANG Tingting1，WANG Chunhong1，JI Tian1，YU Ting1，WU Zhihai2
(1 College of Life Science，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China; 2 College of Agronomy，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China)

Abstract:【Objective】The purpose of this study was to explore the expression differences of glutamine synthetase (GS) gene family members in 3 types of soybean during growth stages and understand the characteristics of protein formation of soybean with high protein content.【Method】GS gene expression quantity and glutamine synthetase activaty (GSA) in root，stem，leaf and root nodul from three tested materials，Glycine max，G.max with high protein content and G.soja with high protein content，were investigated at whole growth stage，respectively.【Result and conclusion】The results were two as follows: the expression of each GS gene member in different organs of three types of soybean was obviously different.GSβ1 in root，stem，leaf and root nodules all expressed high.The expression quantity of GS2 in leaf was significantly higher than that of the other two organs and root nodules.The expression of GSγ1 inbook=84,ebook=88nodule increased，while the expression of GSγ1 in roots，stems，leaf was very low.The expression quantity of GSβ1 in root，stem，leaf and root nodules in whole growth period，GS2 in leaf，GSγ1 in root nodule and the general expression quantity of GS genes at V3－R3 stages were higher in high protein soybean variety than those of normally cultivated soybean variety.This variation was consistent with the variational rule of GSA of three types of soybean.Compared with G.max，effectively regulating the expression of GS gene family members and obtaining high GSA in the whole growth period are characteristics of high protein content soybean.

Key words:Glycine soja of high protein content; Glycine max of high protein content; Glycine max; GS gene; gene expression; glutamine synthetase ativaty(GSA)

基金項目:國家自然科學基金(31201687) ;吉林省自然科學基金(20101573)

作者簡介:楊美英(1974—)，女，副教授，博士，E-mail: jlaumeiying@ 163.com;韓紅(1988—)，女，碩士研究生，E-mail: hanhonghh1988@163.com;對本文具有同等貢獻;通信作者:武志海(1975—)，男，副教授，博士，E-mail: wuzhihai1116@163.com

收稿日期:2014-02-21

文章編號:1001-411X(2015) 03-0083-08

文獻標志碼:A

中圖分類號:S565.101