張　鑫　郝玉琴

?

·綜述·

RNA干擾技術(shù)的研究進(jìn)展

張?chǎng)?，2郝玉琴1

RNA干擾技術(shù)具有高特異性、高效性等顯著優(yōu)勢(shì)，近年在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，包括基因組研究、病毒性疾病治療、腫瘤治療、自身免疫性疾病治療及新藥開發(fā)等。本文就RNAi技術(shù)的研究現(xiàn)狀作一綜述。

RNA干擾技術(shù)；醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景

2002年12月20日，RNA干擾(RNA interference，RNAi)被science雜志評(píng)為年度十大科技成就之首，Nature雜志亦將siRNA評(píng)為年度重大科技成果之一。RNAi 作為一門新興技術(shù)以其高特異性、高效性等顯著優(yōu)勢(shì)成為研究基因功能的全新手段，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

1　RNAi發(fā)展背景

1990年，Jorgensen試圖在矮牽牛花中插入一種色素基因，希望能使花朵的顏色變得更深，結(jié)果卻得到了白色花朵的矮牽?；?，當(dāng)時(shí)他把這一現(xiàn)象稱為共抑制[1]。1994年Cogoni 在真菌中發(fā)現(xiàn)同種現(xiàn)象,被其稱為基因壓制[2]。1995年，Guo等[3]用反義RNA技術(shù)阻斷線蟲par-1基因的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)正義RNA具有與反義RNA同樣可以抑制該基因表達(dá)的作用。1998年Fire等[4]發(fā)現(xiàn)將dsRNA注入線蟲體內(nèi)后可抑制序列同源基因的表達(dá)，遂將這種現(xiàn)象命名為RNA干擾(RNA interference)，簡稱RNAi。2001年Elbashir等[5]用siRNA率先在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)的細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性基因沉默，從而開始了RNAi 技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的研究應(yīng)用。2002年，Brummelkamp等首次成功構(gòu)建了小發(fā)夾RNA( small hairpin RNA，shRNA)表達(dá)載體，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染該載體可特異性、有效地降低目的基因表達(dá)，為RNAi 技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)[6]。

2　RNA干擾技術(shù)原理及特點(diǎn)

2.1RNAi包括兩個(gè)階段分別為起始階段和效應(yīng)階段。在RNAi起始階段中，加入的小分子RNA被切割成21-23 bp長的小分子干擾RNA片段(smallinterferingRNA，siRNA)。Dicer酶是RNAseIII家族中特異性識(shí)別雙鏈RNA的成員之一，它可以以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入的或是由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA(dsRNA)，將RNA降解為21-23bp的siRNA雙鏈，并且每個(gè)片段的3'端都有2個(gè)突出的堿基。在效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物，形成了RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNAinduced silencing complex，RISC)。其正義鏈被釋放出來后，反義鏈將作為引導(dǎo)鏈與靶mRNA作用。激活RISC需要一個(gè)ATP，激活的RISC通過堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄體上，并且在距離siRNA 3'端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但是每個(gè)RISC都含有一個(gè)siRNA和一個(gè)不同于Dicer的RNA酶[7]。

2.2RNAi的特點(diǎn)RNAi較反義寡核苷酸核酶、基因敲除等技術(shù)有著無可比擬的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)：(1)高效性:少量的siRNA可以顯著抑制目的基因的表達(dá),具有催化放大效應(yīng)；(2)高特異性:RNAi只降解同源mRNA，而其他mRNA的表達(dá)則不受影響；(3)傳播性:RNAi具有強(qiáng)大的細(xì)胞穿透力，抑制效應(yīng)可以穿過細(xì)胞界限，干擾效應(yīng)可遺傳給后代；(4)ATP依賴性:RNAi的發(fā)生依賴于ATP的參與，因?yàn)樵贒icer酶將dsRNA切割成siRNA過程及RISC過程均需要ATP的參與。

3　RNA干擾的方法及載體

3.1RNA干擾的方法目前RNA干擾的方法最常用的是直接轉(zhuǎn)染siRNA和構(gòu)建shRNA載體。目前獲得siRNA主要有三種方法，化學(xué)合成、體外酶法合成和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄。因siRNA 相對(duì)分子量較小，在血漿中半衰期較短，極不穩(wěn)定，siRNA在體內(nèi)作用時(shí)間短，使其應(yīng)用受到限制。shRNA是一段具有緊密發(fā)卡環(huán)的RNA序列，通過載體將克隆其編碼的DNA導(dǎo)入細(xì)胞，在細(xì)胞中，shRNA被加工成siRNA，發(fā)揮抑制特異mRNA表達(dá)的作用,這種裝載了shRNA的載體可以通過篩選穩(wěn)定傳遞到子代細(xì)胞中去[8]。載體介導(dǎo)shRNA表達(dá)技術(shù)能長期和穩(wěn)定地抑制靶基因的表達(dá)，這使不能持久抑制基因表達(dá)的問題迎刃而解，可用來構(gòu)建理想的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型，與化學(xué)合成siRNA法相比具有更大的應(yīng)用潛力，因此shRNAs表達(dá)載體技術(shù)成為腫瘤基因治療的強(qiáng)大工具。

3.2RNA干擾的載體載體是引入外源性基因不可或缺的重要工具，如何設(shè)計(jì)和構(gòu)建能夠跨細(xì)胞內(nèi)外生理屏障，實(shí)現(xiàn)較高轉(zhuǎn)染效率并具有低細(xì)胞毒性的基因載體系統(tǒng)一直是基因治療領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。目前基因載體主要分為病毒載體和非病毒載體。

3.2.1病毒載體病毒載體易于制備、純化、濃縮，且具有宿主范圍廣、感染率高、理化性質(zhì)穩(wěn)定、不整合宿主基因組等優(yōu)點(diǎn)，因此，使用頻率較高。其中應(yīng)用較多的為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體主要來源于莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)，它能穩(wěn)定的整合進(jìn)宿主細(xì)胞中，但是只能感染增殖細(xì)胞中而不能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)非增殖細(xì)胞。

腺病毒載體優(yōu)點(diǎn)在于導(dǎo)入效率高，對(duì)增殖或非增殖細(xì)胞均可感染，載體包裝能力強(qiáng)、細(xì)胞毒性反應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)。但還存在著外源基因表達(dá)的可控性差，無靶向性也可引起機(jī)體的免疫反應(yīng)等。

慢病毒載體感染效率很高，且感染后整合穩(wěn)定，慢病毒也可以感染分裂期和不分裂細(xì)胞[9]，如肌纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體比較, 具有高效整合、高效轉(zhuǎn)錄、高效表達(dá)和宿主范圍廣的特點(diǎn),因此成為當(dāng)前基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中載體研究的熱點(diǎn)。

3.2.2非病毒載體近年來，非病毒載體受到關(guān)注，其原因主要是非病毒載體系統(tǒng)安全性高、負(fù)載量大、生物相容性好、便于保存和檢驗(yàn)等優(yōu)勢(shì)。目前在介導(dǎo)RNAi研究中較常用的非病毒載體主要有：陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高，毒副作用較大；陽離子細(xì)胞穿膜肽生物降解性好，負(fù)載率尚有不足；樹枝狀大分子負(fù)載量大，轉(zhuǎn)染效率不高；陽離子聚合物載體種類繁多，以聚乙烯亞胺為例，負(fù)載量大、轉(zhuǎn)染效率較高、毒性大；納米無機(jī)材料負(fù)載量大、毒性低、生物相容性好，但是轉(zhuǎn)染效率有待提高[10]。納米粒子作為非病毒載體，已被廣泛用于RNAi技術(shù)的效應(yīng)分子小分子干擾RNA的遞送[11]。但納米載體的設(shè)計(jì)仍然相當(dāng)困難，DNA與納米粒子的結(jié)合技術(shù)非常復(fù)雜，開發(fā)安全、高效、靶向的納米基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體任重而道遠(yuǎn)。

4　RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用

4.1基因功能研究的應(yīng)用目前的研究是通過抑制某基因的表達(dá)來闡述該基因功能，通過RNAi特異性地抑制基因的表達(dá)來闡明基因在生物體中的功能，較傳統(tǒng)方法如基因敲除省時(shí)方便。隨著人類基因組測(cè)序計(jì)劃的完成，研究已經(jīng)進(jìn)入后基因組時(shí)代，基因組學(xué)的重心已由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)。RNAi技術(shù)以其高度特異性、高效性、操作簡單等特點(diǎn)，成為研究基因功能的重要工具。許多研究工作者通過 RNAi 技術(shù)對(duì)人類基因組進(jìn)行逐一“敲除”，并將細(xì)胞或者組織的表現(xiàn)記錄下來，建立一個(gè)人類RNAi文庫，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)[12]。

4.2抗病毒治療的應(yīng)用RNAi是生物體內(nèi)廣泛存在的一種古老的基因水平的免疫監(jiān)控機(jī)制，用以對(duì)抗病毒感染[13]。目前，借助RNAi技術(shù)治療病毒感染性疾病仍然是其主要的應(yīng)用研究領(lǐng)域。HIV感染目前還缺乏有效的疫苗和治療方法，RNA干擾技術(shù)的問世，為HIV感染者帶來新的希望。有學(xué)者[14]通過構(gòu)建一株包含CCR5 shRNA、人類/獼猴TRIM 5α基因和核仁內(nèi)反式激活反應(yīng)元件類似物的慢病毒載體，感染了該重組慢病毒的CD34+造血干細(xì)胞在人源化免疫缺陷小鼠體內(nèi)可以分化為HIV-1抗性的CD4+T細(xì)胞，這為HIV感染者的治療提供了理論基礎(chǔ)。此外RNAi 技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，并且已經(jīng)成功抑制了多種病毒的復(fù)制，如乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)[15]、丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)[16]、流感病毒(influenza virus A)[17]等。

4.3抗腫瘤治療的應(yīng)用腫瘤基因治療的安全性、有效性及特異性的特點(diǎn)，使近年來受到越來越多的關(guān)注，并且取得了突出的研究成果。Zhen等[18]構(gòu)建了靶向survivin的shRNA載體并轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)分析細(xì)胞顯示：細(xì)胞有絲分裂發(fā)生障礙，凋亡明顯增加。該作者通過建立U251裸鼠移植瘤模型，用survivin-shRNA進(jìn)行干預(yù)，定期觀察并測(cè)量腫瘤大小，3周腫瘤體積和重量均明顯低于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)survivin-shRNA還可以抑制腫瘤血管的生成。Zhao等[19]用肺癌A549細(xì)胞作為研究對(duì)象，構(gòu)建了livin和survivin的shRNA的真核表達(dá)載體，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染組對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長抑制和促凋亡作用明顯高于對(duì)照組和單轉(zhuǎn)染組。這些研究成果為RNAi技術(shù)在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。腫瘤是多個(gè)基因相互作用調(diào)控的結(jié)果，RNAi技術(shù)是一項(xiàng)高特異性和高效率的基因沉默技術(shù)，且RNAi可同時(shí)沉默多個(gè)腫瘤相關(guān)基因，因此RNAi技術(shù)成為目前腫瘤治療方法的研究熱點(diǎn)，其在腫瘤相關(guān)基因的功能研究和基因治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

4.4在自身免疫性疾病治療中的應(yīng)用RNAi技術(shù)近年來亦被用于自身免疫性疾病的研究,Crispin等[20]用siRNA技術(shù)處理系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的T細(xì)胞，結(jié)果顯示白細(xì)胞介素-2(IL-2)的分泌水平得以恢復(fù)。而IL-2的減少是SLE 最主要的免疫病理學(xué)表現(xiàn)。Wang等[21]通過RNA干擾人類枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶6(PCSK6)，觀察其對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(RASF)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制RASF增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，這表明抑制PCSK6可能在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的發(fā)展起到一定的保護(hù)作用。這些研究成果表明，RNAi技術(shù)的出現(xiàn)無疑為自身免疫性疾病的治療開辟了新的思路和途徑。

4.5藥物開發(fā)及應(yīng)用利用 RNAi能夠特異高效地抑制基因表達(dá)，獲得去基因功能表型，能夠在短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模篩選靶點(diǎn)，用RNAi技術(shù)篩選藥靶和評(píng)定藥靶大大縮短了藥物研發(fā)時(shí)間。Duff等[22]通過RNAi技術(shù)減少蛋白轉(zhuǎn)移酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK 9)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)能有效降低小鼠血清膽固醇水平，說明沉默PCSK 9可成為治療高膽固醇的藥物靶點(diǎn)。在篩選藥物上，Liu-Sullivan等[23]通過pooled shRNA的方法發(fā)現(xiàn)維A酸類藥物能增強(qiáng)PLK1激酶抑制劑藥物GSK461364的抑制作用，進(jìn)而阻止肺癌細(xì)胞有絲分裂，加速肺癌細(xì)胞凋亡的速度。癌癥是多基因或多因素作用引起的疾病，靶向單個(gè)分子的RNAi藥物通常不能滿足治療需要，因此有必要設(shè)計(jì)同時(shí)抑制疾病相關(guān)的多個(gè)關(guān)鍵基因的多靶siRNA來調(diào)控疾病的多個(gè)節(jié)點(diǎn)[24]。癌癥的治療幾乎是多靶點(diǎn)藥物組合療法，它越來越多地用于艾滋病的預(yù)防和治療、腦缺血、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病等[25]。

5　RNA干擾技術(shù)的展望

RNAi 沉默機(jī)制的高效性、特異性及穩(wěn)定性使這項(xiàng)技術(shù)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一次劃時(shí)代的革命。它的出現(xiàn)給基因功能研究、生物基因工程、醫(yī)藥研究提供了一種全新的方法。雖然RNAi技術(shù)在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究中取得了一定的成果，并顯示出良好的應(yīng)用前景，但在該技術(shù)廣泛用于臨床前，仍存在一些問題亟待解決。如如何將siRNA安全有效的導(dǎo)入細(xì)胞，并使其在體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。siRNA作為藥物應(yīng)用的主要障礙在于藥物運(yùn)送系統(tǒng)及給藥方式，開發(fā)一個(gè)安全高效的運(yùn)載系統(tǒng)仍是科研工作者和臨床醫(yī)師亟待解決的問題。隨著研究的深入我們相信這些問題最終會(huì)被解決，RNAi作為一門新興技術(shù)正顯示著強(qiáng)大的生命力。該技術(shù)將更廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究和疾病的臨床治療中,這將是目前無法治療的疾病在基因治療方面的一場(chǎng)新革命。

[1] Sinha SK. RNAi induced gene silencing in crop improvement[J]. Physiol Mol Biol Plants,2010,16(4):321-332.

[2] Cogoni C, Romano N, Macino G. Supperession of gene expression by homologous transgenses[J]. Antonie Van Leeuwenhoek,1994,65(3):205-209.

[3] Guo S, Kemphues KJ. Par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative ser/thr kinase that is asymmetrically distributed[J]. Cell,1995,81(4):611-620.

[4] Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in caenorhabditis elegans[J]. Nature,1998,391(6669):806-811.

[5] Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J]. Nature,2001,411(6836):494-498.

[6] Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells[J]. Science,2002,296 (5567):550-553.

[7] Zhu R, Shevchenko O, Ma C, et al. Poplars with a PtDDM1-RNAi transgene have reduced DNA methylation and show aberrant post-dormancy morphology[J]. Planta,2013,237(6):1483-1493.

[8] Tijsterman M, Ketting RF, Plasterk RH. The genetics of RNA silencing[J]. Annu Rev Genet,2002,36:489-519.

[9] Hüsser L, Alves MP, Ruggli N, et al. Identification of the role of RIG-I, MDA-5 and TLR3 in sensing RNA viruses in porcine epithelial cells using lentivirus-driven RNA interference[J]. Virus Res,2011,159(1):9-16.

[10] 李澤豪，任小元，王世兵，等.介導(dǎo)siRNA傳遞的非病毒載體及其研究進(jìn)展[J].生命科學(xué),2014,26(4):392-399.

[11] Yuan X, Naguib S, Wu Z. Recent advances of siRNA delivery by nanoparticles[J]. Expert Opin Drug Deliv,2011,8(4):521-536.

[12] Matheis F, Besch R. Bifunctional siRNAs for tumor therapy[J]. Methods Mol Biol,2014,1169:181-192.

[13] Sanghvi VR, Steel LF. A re-examination of global suppression of RNA interference by HIV-1[J]. PLoS One,2011,6(2):e17246.

[14] Walker JE, Chen RX, McGee J, et al. Generation of an HIV-1-resistant immune system with CD34(+) hematopoietic stem cells transduced with a triple-combination anti-HIV lentiviral vector[J]. J Virol,2012,86(10):5719-5729.

[15] Ivacik D, Ely A, Ferry N, et al. Sustained inhibition of hepatitis B virus replication in vivo using RNAi-activating lentiviruses[J]. Gene Ther,2015,22(2):163-171.

[16] Torrecilla J, del Pozo-Rodriquez A, Apaolaza PS, et al. Solid lipid nanoparticles as non-viral vector for the treatment of chronic hepatitis C by RNA interference[J]. Int J Pharm,2015,479(1):181-188.

[17] Su WC, Chen YC, Tseng CH, et al. Pooled RNAi screen identifies ubiquitin ligase itch as crucial for influenza A virus release from the endosome during virus entry[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(43):17516-17521.

[18] Zhen HN, LI LW, Zhang W, et al. Short hairpin RNA targeting survivin inhibits growth and angiogenesis of glioma U251 cells[J]. Int J Oncol,2007,31(5):1111-1117.

[19] Zhao X, Yuan Y, Zhang Z, et al. Effects of shRNA-silenced livin and survivin on lung cancer cell proliferation and apoptosis[J]. J Buon,2014,19(3):757-762.

[20] Crispin JC, Apostolidis SA, Finnell MI, et al. Induction of PP2A Bβ, a regulator of IL-2 deprivation-induced T-cell apoptosis,is deficient in systemic lupus erythematosus[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(30):12443-12448.

[21] Wang F, Wang L, Jiang H, et al. Inhibition of PCSK6 may play a protective role in the development of rheumatoid arthritis[J]. J Rheumatol,2015,42(2):161-169.

[22] Duff CJ, Hoooper NM. PCSK9:an emerging target for treatment of hypercholesterolemia[J]. Expert Opin Ther Targets,2011,15(2):157-168.

[23] Liu-Sullivan N, Zhang J, Bakleh A, et al. Pooled shRNA screen for sensitizers to inhibition of the mitotic regulator polo-like kinase (PLK1)[J]. Oncotarget,2011,2(12):1254-1264.

[24] Efferth T, Koch E. Complex interactions between phytochemicals. The multi-target therapeutic concept of phytotherapy[J]. Curr Drug Targets,2011,12(1):122-132.

[25] Lu JJ, Pan W, Hu YJ, et al. Multi-target drugs: the trend of drug research and development[J]. PLoS One,2012,7(6):e40262.

(收稿：2015-04-21修回：2015-08-26)

Update of RNA interference technology

ZHANGXin1，2,HAOYuqin1.

1.DepartmentofDermatology,ThirdAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Baotou014010,China; 2.InnerMongoliaMedicalUniversity,Huhhot010000,China

HAOYuqin，E-mail:haoyuqin0472@163.com

RNA interference (RNAi) technology is superiority of the high particularity and efficiency, which is wildly used in medical sciences including genomic research in medicine, viral therapy, the treatment of cancer and autoimmune diseases and new drug development. The update of RNA interference technology was reviewed.

RNA interference technology; medical application prospects

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：81260407 )

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚科，包頭，014010

2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，呼和浩特，010000

郝玉琴，E-mail:haoyuqin0472@163.com