田洪榛，柏翠芳，陳光輝

· 綜述 ·

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展及在心臟疾病中的應(yīng)用

田洪榛1，2，柏翠芳3，陳光輝1

近年來人們飲食及生活方式發(fā)生了巨大變化，特別是人口老齡化的加速，我國面臨心臟疾病發(fā)病率和死亡率快速增長的嚴(yán)峻形勢。心肌細(xì)胞是不可再生細(xì)胞，常規(guī)藥物治療、血運(yùn)重建、冠狀動(dòng)脈旁路移植等均不能使心肌細(xì)胞再生，尋找能夠彌補(bǔ)心肌缺失的方法顯得極為迫切。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有自我更新、不斷增殖、多向分化和免疫調(diào)節(jié)等能力，已成為再生醫(yī)學(xué)的研究焦點(diǎn)。1970年，F(xiàn)riedenstein等首次在骨髓中發(fā)現(xiàn)并提取到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）［1］。但從骨髓中提取BMMSCs的過程復(fù)雜，并對捐獻(xiàn)者造成損傷。胚胎干細(xì)胞（ESCs）能分化成體內(nèi)所有的細(xì)胞，是多能性干細(xì)胞的典型代表。近年研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）具有與ESCs相似的多能性［2］。多能性是指這些細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠時(shí)可分化成三胚層（外胚層、中胚層及內(nèi)胚層）的任意細(xì)胞的能力。但是胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的倫理問題。而iPSCs可能存在如c-myc的融合致癌基因、插入突變、抑癌基因破壞等情況［3］，其臨床應(yīng)用受到批評與限制。尋找新的干細(xì)胞來源成為當(dāng)務(wù)之急。

近期兩項(xiàng)“吸血鬼療法”的研究結(jié)果引人關(guān)注。研究者將幼鼠的血液移植注入年長小鼠體內(nèi)，隨后觀察到年長小鼠的肌肉組織增加及神經(jīng)功能的恢復(fù)，提示該效應(yīng)與幼鼠血液中的干細(xì)胞密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)血液中生長分化因子11（GDF11）和環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB）與此效應(yīng)相關(guān)［4，5］。人類干細(xì)胞主要來自羊水、臍帶和胎盤，主要是間充質(zhì)干細(xì)胞。因人臍帶來源豐富，不對捐獻(xiàn)者造成損傷，不產(chǎn)生倫理問題，成本較低，目前人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUCMSCs）正被廣泛研究。

1　HUCMSCs來源

人臍帶在懷孕的第5周開始發(fā)育，并繼續(xù)生長至50 cm左右。臍帶由三部分構(gòu)成：羊膜被覆上皮、臍血管和位于兩者之間的黏液結(jié)締組織—沃頓膠質(zhì)。沃頓膠質(zhì)對臍血管臍帶有保護(hù)和支持作用。臍帶的粗細(xì)和重量主要取決于沃頓膠質(zhì)的數(shù)量。2003年，Mitchell等［6］首先在沃頓膠質(zhì)提取分離出具有多項(xiàng)分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，此后很多研究應(yīng)用這種干細(xì)胞，并被稱作臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

2　HUCMSCs的一般生物學(xué)特性

2.1HUCMSCs的細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)志 組織塊貼壁7 d后可見單個(gè)的梭形或多角形成纖維樣細(xì)胞；傳代后的細(xì)胞形態(tài)為相對均一的梭形，呈平行排列或旋渦狀、魚群狀排列生長。透射電鏡下觀察多次傳代后的細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，活性穩(wěn)定。HUCMSCs體外培養(yǎng)傳代超過80代而沒有細(xì)胞形態(tài)的改變和細(xì)胞衰老跡象［6］。目前還沒有發(fā)現(xiàn)HUCMSCs的特異分子標(biāo)記，只能通過檢測其免疫表型來間接鑒定。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，HUCMSCs高表達(dá)MSCs標(biāo)記（CD73、CD90、CD105）和黏附分子標(biāo)記（CD54、CD13、CD29、CD44），低表達(dá)MHC-Ⅰ分子標(biāo)記（HLA-ABC）等，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記（CD31、CD34、CD45、CD117、CD14）、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記（CD33、CD133）及MHC-Ⅱ分子標(biāo)記（HLA-DR、-DA、-DP、-DQ）等［7］。據(jù)報(bào)道HUCMSCs與ESCs的基因信息近似，HUCMSCs低表達(dá)一些轉(zhuǎn)錄因子如Oct-4、Sox-2、Nanog、KLF-4等，這些轉(zhuǎn)錄因子也多在ESCs表達(dá)［8］。

2.2HUCMSCs的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用

2.2.1HUCMSCs具有極低的免疫原性 大量研究證實(shí)，HUCMSCs表達(dá)的 CD106、HLA-ABC 明顯低于 BMMSCs，因此HUCMSCs較BMMSCs具有更低的免疫原性［9］。在腦損傷和退行性變的動(dòng)物試驗(yàn)中進(jìn)行細(xì)胞移植，發(fā)現(xiàn)機(jī)體并未針對移植細(xì)胞產(chǎn)生排斥反應(yīng)［10］。近年來關(guān)于HUCMSCs的免疫特性進(jìn)行了詳細(xì)的研究，Troyer和Weiss得出的結(jié)論是在體內(nèi)開放免疫環(huán)境中未見機(jī)體對HUCMSCs的免疫排斥，HUCMSCs在同種異基因移植的耐受性良好［11］。

2.2.2HUCMSCs的免疫調(diào)節(jié)作用 HUCMSCs可通過高表達(dá)白介素6（IL-6）和血管生長因子來抑制T細(xì)胞增殖［12］，高表達(dá)具有抑制孕體胎兒排斥、介導(dǎo)異體皮和心臟移植免疫耐受效應(yīng)的CD200［13］。還有研究表明HUCMSCs高表達(dá)人類白細(xì)胞抗原G（HLA-G）［14］或通過前列腺E2機(jī)制［15］抑制T細(xì)胞增殖，介導(dǎo)免疫耐受。HUCMSCs低水平表達(dá)ESCs的分子標(biāo)記—OCT4，Nanog，Sox2和LIN28，從而能解釋將其移植到免疫缺陷大鼠體內(nèi)不產(chǎn)生畸胎瘤［16］。已證實(shí)在體外及小鼠體內(nèi)HUCMSCs能抑制人乳腺癌細(xì)胞的生長，其抗癌作用可能通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸或分泌相關(guān)因子，使細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及腫瘤抑制基因表達(dá)上調(diào)［17］。將HUCMSCs與樹突狀細(xì)胞共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，成熟樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志CD80、CD83、CD86水平下降，HUCMSCs直接降低了樹突狀細(xì)胞的共刺激分子和抗原呈遞能力，避免T細(xì)胞啟動(dòng)［18］。HUCMSCs能表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)功能的因子，如IDO-1、IL-10、LIF、PD-L1、COX-2、TGF-β1、TSG-6、CD200、HGF、HLA-E、HLA-G和HO-1，將HUCMSCs與T細(xì)胞共同培養(yǎng)，其通過接觸依賴機(jī)制和IDO-1等可溶性分子抑制T細(xì)胞增殖，并可激活T細(xì)胞抑制TGF-γ的水平，誘導(dǎo)IL-10分泌［19］。這些研究表明HUCMSCs在體外對T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

3　HUCMSCs的多分化潛能

既往研究證實(shí)HUCMSCs在體外、體內(nèi)均可分化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝樣細(xì)胞、胰島細(xì)胞等［20，21］。

3.1HUCMSCs向心肌細(xì)胞分化的方法 已經(jīng)證實(shí)向培養(yǎng)基中加入5氮胞苷（5-Aza）、二甲基亞砜（DMSO）、1-磷酸鞘氨醇（S1P）等誘導(dǎo)劑，能在體外誘導(dǎo)HUCMSCs定向分化為心肌樣細(xì)胞。國外發(fā)現(xiàn)血管緊張素受體阻滯劑和匹格列酮等可促進(jìn)HUCMSCs分化為心肌樣細(xì)胞［22，23］。

3.2HUCMSCs誘導(dǎo)心肌樣細(xì)胞機(jī)制 5-Aza處理HUCMSCs后，DLL4和Notch1基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)水平升高（7 d時(shí)分別高達(dá)初始水平的7.8和11.4倍）［24］，GATA4和Flk-1、Nkx2.5、Isl-1、Brachyury（T）等心臟發(fā)育過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增高，肌鈣蛋白I（cTnI）表達(dá)水平增高［25］。提示DLL4-Notch信號通路在HUCMSCs向心肌樣細(xì)胞的分化過程中有重要作用。還有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-Aza處理后，HUCMSCs的ERK磷酸化水平和MEF-2蛋白表達(dá)升高，進(jìn)而引發(fā)STAT3磷酸化以及MEF-2C和MyoD基因表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)一步激活心肌特異基因包括desmin、β-MHC、NKx2.5、cTnT、ANP 的轉(zhuǎn)錄，使HUCMSCs向心肌樣細(xì)胞分化［26］。

研究證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5促進(jìn)HUCMSCs分化為心肌樣細(xì)胞，并使心肌樣細(xì)胞的cTnI、Desmin、Nkx2.5和GATA-4表達(dá)增加［27］。缺氧預(yù)處理能增強(qiáng)HUCMSC的增殖和向心肌樣細(xì)胞分化的能力，增加HUCMSCs和分化心肌樣細(xì)胞的抗缺氧能力，提高其在治療心肌梗死及心力衰竭的存活率［28］。急性心肌梗死大鼠模型的試驗(yàn)提示，在急性心肌梗死后梗死相關(guān)的生物和物理因子通過TGF-β/ BMP-2途徑誘導(dǎo)HUCMSCs向心肌樣細(xì)胞分化［29］。干細(xì)胞的分化涉及多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，多條信號通路及相互作用，最終才能分化為特定的終末分化細(xì)胞。目前仍需進(jìn)一步研究來了解干細(xì)胞的分化機(jī)制。

4　HUCMSC在心臟疾病的臨床應(yīng)用

Sun L等［30］將HUCMSCs經(jīng)靜脈輸注到兔、豚鼠和大鼠后，未觀察到肝臟、腎臟功能損害，無溶血及全身過敏反應(yīng)，熱原及血液學(xué)指標(biāo)未見異常，提示HUCMSCs的免疫耐性良好，經(jīng)靜脈途徑應(yīng)用安全。許多急性心肌梗死的動(dòng)物模型試驗(yàn)提示移植HUCMSCs后，能通過保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡、促進(jìn)血管生成、減少心肌纖維化等作用，提高左室射血分?jǐn)?shù)、縮小心肌梗死面積、改善心臟收縮功能［31，32］。

Xia等［33］對15例高齡冠心病合并冠狀動(dòng)脈慢性閉塞的患者進(jìn)行了HUCMSCs經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植，隨訪2年期間未發(fā)生心血管不良事件、心律失常等，患者的左室收縮功能顯著改善，心肌缺血及梗死面積縮小，這些效應(yīng)與HUCMSCs對血管緊張素、醛固酮及炎癥因子的作用相關(guān)。Gao等［34］開展了關(guān)于HUCMSCs一項(xiàng)隨機(jī)雙盲對照研究，將116例急性ST段抬高的心肌梗死患者隨機(jī)分成治療組和安慰劑組，在成功血運(yùn)重建后，治療組經(jīng)冠狀動(dòng)脈注入了干細(xì)胞混懸液，隨訪18個(gè)月發(fā)現(xiàn)治療組的心肌活力增加、梗死面積縮小，左室射血分?jǐn)?shù)明顯升高，左室舒張末期容積和左室收縮末期容積明顯減小，提示經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植HUCMSCs治療急性心肌梗死是一種安全有效的方法。Samuel Golpanian等［35］對TESI和TAC-HFT兩項(xiàng)隨機(jī)研究進(jìn)行亞組分析顯示：心內(nèi)膜下注射間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性心肌病在年齡大于60歲或小于60歲的患者均安全有效，年齡不影響干細(xì)胞的治療效果。Mushtaq M等［36］正在進(jìn)行POSEIDON-DCM的隨機(jī)對照研究，這是一個(gè)關(guān)于自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對擴(kuò)張型心肌病的治療效果與安全性的研究，期待試驗(yàn)結(jié)果的公布。

綜上，HUCMSCs具有極低的免疫原性、良好的多分化潛能和免疫調(diào)節(jié)、抗癌效應(yīng)，其來源豐富，成本低，對供體無損傷，不涉及倫理問題，是再生醫(yī)學(xué)研究的重要成員。目前已嘗試在包括心肌梗死、心力衰竭、心肌病、白血病、糖尿病、多發(fā)性硬化等多系統(tǒng)多種疾病應(yīng)用，但治療機(jī)制還不十分清楚，其治療的安全性及長期療效更需大樣本、多中心的隨機(jī)前瞻性試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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本文編輯：姚雪莉

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