向志雄劉文麗（上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院 上海 201203）

UPLC-MS/MS 法測(cè)定比格犬血漿中雙氯芬酸鈉的濃度

向志雄*劉文麗
（上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院 上海 201203）

摘 要目的：建立靈敏的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定比格犬血漿中的雙氯芬酸鈉的濃度。方法：選用BEH C18（2.1 mm×100 mm, 1.7 mm）色譜柱，以乙腈-醋酸銨（2 mmol·L-1）-甲酸（70∶30∶0.1，v/v/v）為流動(dòng)相，采用等度洗脫進(jìn)行分離，樣品采用含0.1% 甲酸的乙腈進(jìn)行蛋白沉淀后進(jìn)樣，通過(guò)電噴霧電離源, 以多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式進(jìn)行負(fù)離子檢測(cè), 用于定量分析的離子對(duì)為m/z （293.9+293.9+296.1）→（249.9+213.7+251.8） (雙氯芬酸)和m/z 283.0→239.0（內(nèi)標(biāo), 大黃酸）測(cè)定雙氯芬酸鈉。結(jié)果：雙氯芬酸鈉的線性范圍為：1.0 ~ 3 000.0 ng·ml-1；定量下限可達(dá)1.0 ng·ml-1；日內(nèi)、日間精密度（RSD）均小于15 %。結(jié)論: 本方法同時(shí)選擇3個(gè)碎片離子作為雙氯芬酸鈉定量產(chǎn)物離子，明顯的改進(jìn)了分析方法的靈敏度, 血漿用量少,適用于比格犬血漿樣品中雙氯芬酸鈉的測(cè)定和藥物動(dòng)力學(xué)研究。

關(guān)鍵詞超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 雙氯芬酸鈉 比格犬血漿樣品檢測(cè) 血藥濃度

文獻(xiàn)標(biāo)示碼：A

UPLC-MS/MS determination of the diclofenac sodium (DS) in dog plasma

XIANG Zhixiong*, LIU Wenli
(Central Research Institute, Shanghai Pharmaceuticals Holding Co. Ltd., Shanghai 201203, China)

ABSTRACTObjective: To develop a UPLC-MS/MS method for determination of diclofenac sodium (DS) in dog plasma. Methods: DS and internal standard were extracted from plasma by acetonitrile containing 0.1% formic acid and separated on a column BEH C18（2.1 mm×100 mm, 1.7 mm）using acetonitrile-ammonium acetate (2 mmol·L-1)-formic acid (0.1%) (70∶30∶0.1, v/v/v) as a mobile phase. A tandem mass spectrometer equipped with electrospray ionization source was adopted as a detector. Multiple reaction monitoring (MRM) transitions of m/z (293.9+293.9+296.1) →(249.9+213.7+251.8), m/z 283.0→239.0 were measured in negative mode for DS and internal standard rhein, respectively. Results: The calibration curve for DS was linear over the range of 1.0~3 000.0 ng·ml-1and the lower limit of quantification was 1.0 ng·ml-1with the relative standard deviation of intra-day and inter-day over the entire concentration range less than 15%. Conclusion: This method is sensitive and suitable for pharmacokinetic study of DS in dog subjects.

KEY WORDSUPLC-MS/MS; diclofenac sodium; Beagle dog plasma sample testing; plasma concentration

雙氯芬酸鈉雙釋放腸溶膠囊（diclofenac sodium，DS）是一種非甾體抗炎藥，它具有獨(dú)特的雙釋放系統(tǒng)，主要通過(guò)抑制前列腺素合成而發(fā)揮抗風(fēng)濕、消炎、鎮(zhèn)痛及解熱作用。臨床上常用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肌腱炎、骨關(guān)節(jié)炎、滑囊炎及其他關(guān)節(jié)或關(guān)節(jié)周?chē)不嫉南准版?zhèn)痛[1]。有關(guān)雙氯芬酸鈉血藥濃度的測(cè)定方法，國(guó)內(nèi)外報(bào)道主要有 HPLC-UV、GC、LC-MS、LC-MS/MS 和UPLC-MS/MS法[2-8]，分析時(shí)間較長(zhǎng)，前處理方法有蛋白沉淀、液-液萃取、固相萃取，血漿需求量一般比較大（0.1~2.0 ml），靈敏度較低（2.5～80 ng·ml-1）。有關(guān)比格犬血漿中雙氯芬酸鈉的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定方法，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，僅有一篇關(guān)于兔血漿中雙氯芬酸鈉的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定的報(bào)道[8]。本實(shí)驗(yàn)擬建立快速、靈敏、專(zhuān)屬性強(qiáng)的UPLC-MS/MS法，測(cè)定比格犬血漿樣品中雙氯芬酸鈉的濃度。

1 儀器與試藥

API 4000 QTRAP 型串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源（ESI）以及Analyst 1.5.1數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)Applied Biosystem 公司）；Waters Acquity UPLC系統(tǒng)，

包括二元輸液泵，自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Waters公司）。

雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma，批號(hào)： 075k1896）；大黃酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)： 110757-200206）；乙腈（色譜純，Merck公司）；醋酸銨（色譜純，Tedia公司）；甲酸（色譜純，CNW公司）；其余試劑均為市售分析純級(jí)試劑；實(shí)驗(yàn)用水為去離子超純水；空白Beagle 犬血漿，由復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

DS儲(chǔ)備液：精密稱(chēng)取雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)品3.21 mg，加1 605 ml 50%甲醇溶液溶解，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為2 000 mg· ml-1的雙氯芬酸儲(chǔ)備液。

DS標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：取DS儲(chǔ)備液適量，用乙腈水溶液稀釋配制成DS濃度為60，54， 20，6，2，0.6，0.2，0.04，0.02 mg· ml-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱(chēng)取大黃酸標(biāo)準(zhǔn)品1.88 mg，加200 ml DMSO溶解并加740 ml 乙腈稀釋?zhuān)瑩u勻，配制成質(zhì)量濃度為2 000 mg· ml-1的大黃酸儲(chǔ)備液，取適量的大黃酸儲(chǔ)備液用含0.1% 甲酸的乙腈稀釋到濃度為10.0 ng·ml-1。

2.2 色譜條件

色譜柱：BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 mm，Waters 公司）；流動(dòng)相：乙腈-2 mmol·L-1醋酸銨-甲酸（70∶30∶0.1，v/v/v）；流速：0.3 ml·min-1；分析時(shí)間：2 min; 柱溫：25 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4 ℃；進(jìn)樣量：5 ml。

2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）， 負(fù)離子方式檢測(cè)；離子源電壓（IS）： -4 500 V； 離子源溫度（TEM）： 500℃；霧化氣（Gas 1，N2）壓力： 345 kPa；輔助氣（Gas 2，N2）壓力： 345 kPa；氣簾氣（CUR） 壓力： 138 kPa；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè) （MRM）；碰撞氣（CAD，N2）壓力：Medium；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z （293.9+293.9+296.1）→（249.9+213.7+251.8） （DS，DP電壓：-47 V，-47 V ， -53 V ，CE電壓：-18 V，-30 V，-15 V；CXP電壓：-13 V，-15 V，-15 V），和m/z 283.0→239.0 （大黃酸， DP電壓：-80 V，CE電壓：-22 V；CXP電壓：-17 V）。

2.4 血漿樣品處理

精密取血漿樣品50 ml至1.5 ml EP管中，加入400 ml內(nèi)標(biāo)溶液，混勻后離心10 min（15 200 轉(zhuǎn)/min），取上清液進(jìn)樣5 ml進(jìn)行UPLC-MS/MS定量分析。

2.5 分析方法確證

2.5.1 質(zhì)譜分析

將DS儲(chǔ)備液用乙腈水稀釋到1 μg·ml-1，內(nèi)標(biāo)用乙腈稀釋到1 μg·ml-1，采用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣模式，分別進(jìn)行碎片離子分析，相應(yīng)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖

2.5.2 方法的專(zhuān)屬性

分別取空白血漿，加入DS標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的空白血漿，受試動(dòng)物給藥后收集的血漿樣品100 ml，按照上述“2.4”項(xiàng)下操作及檢測(cè)條件進(jìn)行定量分析，得色譜圖2。結(jié)果表明：內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。

圖2 DS和內(nèi)標(biāo)大黃酸的選擇離子色譜圖

2.5.3 線性關(guān)系

取空白血漿190 ml，加入DS標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10 ml，配制成相當(dāng)于血漿濃度為1.0，2.0，10.0，30.0， 100.0，300.0，1 000.0，2 700.0，3 000.0 ng·ml-1標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。分別按照“2.4”項(xiàng)下操作后進(jìn)樣分析。以血漿中待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)X （ng·ml-1）， 待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)（W =1/X2）最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，求得DS直線回歸方程為：Y=0.030 2X+0.017 4，r =0.997。

根據(jù)工作曲線，DS在1.0 ~ 3 000.0 ng·ml-1范圍內(nèi)線形關(guān)系良好。DS的定量下限為1.0 ng·ml-1。

2.5.4 準(zhǔn)確度與精密度

按“2.4”項(xiàng)下操作，制備DS低、中、高濃度分別為3.0，600.0，2 400.0 ng·ml-1的質(zhì)量控制（QC）樣品，計(jì)算方法的準(zhǔn)確度與精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 血漿中雙氯酚酸鈉UPLC-MS/MS測(cè)定方法的準(zhǔn)確度與精密度（n=18）

2.5.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

按“2.4”項(xiàng)下操作，制備低、中、高3個(gè)濃度的對(duì)照品血漿，每個(gè)濃度6個(gè)樣品。同時(shí)另外取空白血漿50 ml，加入沉淀劑含0.1% 甲酸的乙腈、混勻后離心10 min （15 200 轉(zhuǎn)/min），向獲得的上清液中加入相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，渦流混勻，進(jìn)樣5 ml進(jìn)行UPLCMS/MS分析，獲得相應(yīng)峰面積，以每一濃度2種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率，雙氯酚酸鈉低、中、高3個(gè)濃度的提取回收率±RSD分別為：（85.4±12.2）%，（89.2±8.6）%，（79.0±6.4）%；內(nèi)標(biāo)大黃酸的提取回收率為 （86.2±5.4）%。實(shí)驗(yàn)中對(duì)DS和大黃酸的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察，結(jié)果相對(duì)偏差RE均小于15%，表明血漿無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng)存在。

2.5.6 穩(wěn)定性考察

考察了DS低、中、高濃度分別為3.0、600.0、2 400.0 ng·ml-1在不同條件下的穩(wěn)定性（n=6）。結(jié)果表明：DS室溫放置6 h穩(wěn)定（RE 分別為：14.1%，3.4.%，-5.6%），預(yù)處理后自動(dòng)進(jìn)樣器放置24 h穩(wěn)定（RE 分別為： 14.0 %，8.8 %，0.3 %），3 次凍融循環(huán)穩(wěn)定（RE 分別為：-5.2 %，-12.6 %，7.6 %），-70 ℃放置24 d穩(wěn)定（RE 分別為：6.8 %，13.5 %，8.6 %）。

2.5.7 稀釋效應(yīng)驗(yàn)證試驗(yàn)

本方法中DS的線性范圍為1.0 ~ 3 000.0 ng·ml-1，對(duì)于濃度超出線性范圍的樣品，用空白比格犬血漿稀釋后再測(cè)定，因此進(jìn)行了稀釋效應(yīng)驗(yàn)證試驗(yàn)。配制DS濃度為24 000 ng/ml的6份血漿樣品，精密吸取5 ml，加入空白血漿45 ml，混勻。按“2.4”項(xiàng)下操作后進(jìn)樣分析，結(jié)果準(zhǔn)確度為106.7%，RSD=2.42%，表明血漿樣品稀釋對(duì)測(cè)定結(jié)果沒(méi)有影響。

2.6 方法學(xué)應(yīng)用

未知血漿樣品測(cè)定按 “2.4”項(xiàng)下操作，每個(gè)分析批

建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)分析低、中、高多樣本的質(zhì)控樣品（雙氯芬酸血漿濃度分別為3.0，600.0，2 400.0 ng·ml-1），并穿插于受試者樣品測(cè)定中。根據(jù)當(dāng)批標(biāo)準(zhǔn)曲線求算未知血漿樣品濃度和質(zhì)控樣品濃度，至少67 %的質(zhì)控樣品的相對(duì)偏差在±15%之內(nèi)，此批數(shù)據(jù)方可接收。應(yīng)用本研究所建立的方法測(cè)定8條Beagle犬單劑量灌胃雙氯芬酸鈉雙釋放腸溶膠囊（戴芬，規(guī)格75 mg/粒）1粒后血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3。各受試動(dòng)物24 h前各點(diǎn)血藥濃度均能檢測(cè)到，本方法可以滿(mǎn)足Beagle犬藥物動(dòng)力學(xué)研究。

圖3 8只比格犬灌胃雙氯芬酸鈉雙釋放腸溶膠囊1粒后DS的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

3 討論

用UPLC-MS/MS測(cè)定血藥濃度，具有選擇性好、靈敏度高、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，已普遍地應(yīng)用于藥物動(dòng)力學(xué)研究。最新文獻(xiàn)報(bào)道UPLC-MS/MS法測(cè)定兔血漿中雙氯芬酸用ESI源，并采用1個(gè)響應(yīng)穩(wěn)定的主要粹片離子作為雙氯芬酸定量分析的產(chǎn)物離子，1個(gè)響應(yīng)穩(wěn)定的粹片離子作為雙氯芬酸鈉定性分析的產(chǎn)物離子，但是定量下限只能達(dá)80 ng·ml-1[8]。本實(shí)驗(yàn)同樣選用ESI源，考慮到雙氯芬酸鈉中含有氯同位素，同時(shí)采用3個(gè)響應(yīng)穩(wěn)定的主要粹片離子作為雙氯芬酸定量分析的產(chǎn)物離子，定量下限可達(dá)1 ng·ml-1，大大提高了本方法的靈敏度。

分別嘗試用甲醇和乙腈作為流動(dòng)相中的有機(jī)相，結(jié)果表明后者背景噪音較低，且響應(yīng)約為前者的兩倍，在流動(dòng)相中加入甲酸和醋酸銨可使待測(cè)物的相應(yīng)增加，峰形得到改善。在有效避免離子抑制與內(nèi)源性物質(zhì)干擾的前提下、為了達(dá)到更快的分析速度（本實(shí)驗(yàn)一個(gè)樣品分析時(shí)間僅2 min），最終選用乙腈-2 mmol·L-1醋酸銨-甲酸（70∶30∶0.1，v/v/v）為流動(dòng)相，流速為0.3 ml·min-1。與文獻(xiàn)[8]比較，本法在流動(dòng)相都為酸的情況下，當(dāng)濃度相同時(shí)，甲酸比乙酸的響應(yīng)高，加入緩沖鹽，響應(yīng)更穩(wěn)定。對(duì)比了一些文獻(xiàn)應(yīng)用的內(nèi)標(biāo)非那西汀，發(fā)現(xiàn)大黃酸在所選用的色譜條件下，不僅峰形好、響應(yīng)穩(wěn)定，而且和雙氯芬酸鈉的保留時(shí)間比較接近。

文獻(xiàn)報(bào)道的雙氯芬酸鈉血漿樣品處理方法有蛋白沉淀法、液-液萃取法、固相萃取法等。固相萃取法成本較高，液-液萃取法比沉淀蛋白處理繁瑣，本實(shí)驗(yàn)在不影響靈敏度的前提下，采用了同文獻(xiàn)[8]相同的蛋白沉淀法，并在優(yōu)化沉淀?xiàng)l件時(shí)，對(duì)沉淀試劑進(jìn)行了考察。血漿樣品在不同體積0.1% 甲酸的作為酸化試劑的條件下，分別經(jīng)甲醇、乙腈溶劑進(jìn)行沉淀，通過(guò)UPLC-MS/MS進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)以400 ml含0.1% 甲酸的乙腈為沉淀試劑時(shí)，提取回收率高且提取穩(wěn)定。

綜上，本研究所建立的方法，分析時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)所需血漿量少，快速、靈敏、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于Beagle犬藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，可為雙氯芬酸鈉的臨床藥代動(dòng)力學(xué)提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] Davies NM, Anderson KE. Clinical pharmacokinetics of diclofenac. Therapeutic insights and pitfalls[J]. Clin Pharmacokinet, 1997, 33(3): 184-213.

[2] 魯瑩, 蔣雪濤, 曾仁杰, 等. 雙氯芬酸鈉人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 22(4): 364-366.

[3] 郭海杰, 吳慧哲, 孫明立, 等. 雙氯芬酸鈉緩釋片在健康人體的生物等效性與藥代動(dòng)力學(xué)[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2008, 24(6): 521-525.

[4] 洪春雪, 束怡, 曹宇, 等. 雙氯芬酸鈉緩釋液體栓制備與體內(nèi)外相關(guān)性研究[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版), 2012, 58(4): 281-285.

[5] 何陵湘. 多劑量穩(wěn)態(tài)雙氯芬酸鈉緩釋片的人體生物等效性研究[J]. 河北醫(yī)學(xué), 2007, 13(7): 781-784.

[6] 郭濤, 鄭春麗, 宋洪濤, 等. 雙氯芬酸鈉脈沖控釋微丸的研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 38(9): 707-710.

[7] 任亦飛, 張永東. 雙氯芬酸鈉腸溶片的血藥濃度測(cè)定及人體藥代動(dòng)力學(xué)研究[J]. 實(shí)用醫(yī)技雜志, 2004, 11(9): 547-549.

[8] Alam MA, Al-Jenoobi FI, Al-Mohizea AM. High-throughput ultra-performance LC-MS-MS Method for analysis of diclofenac sodium in rabbit plasma [J]. J Chromatogr Sci, 2015, 53(1): 47-53.

收稿日期：（2015-01-05）

作者簡(jiǎn)介：*向志雄（1978-），男，工程師，主要從事藥物分析和藥物代謝動(dòng)力學(xué)方面的工作。E-mail: xiangzx@sphchina.com

文章編號(hào)：1006-1533(2015)05-0074-04

中圖分類(lèi)號(hào)：R969.1; R971.1