響應(yīng)面分析法優(yōu)化復(fù)方益母草口服液提取工藝研究

河北省唐山市婦幼保健院曹冬梅張偉杜國輝姜海英謝巍(唐山 063000)

提要目的：優(yōu)化復(fù)方益母草口服液提取工藝。方法：通過響應(yīng)面分析法考察溶劑用量、提取次數(shù)和提取時間對鹽酸水蘇堿的含量和浸膏得率的影響。結(jié)果：溶劑用量、提取時間、提取次數(shù)3個因素對綜合評分指標(biāo)具有顯著性影響，結(jié)合單因素實驗結(jié)果和生產(chǎn)實際，復(fù)方益母草口服液最佳提取工藝為加水倍數(shù)9倍，提取時間100 min，提取次數(shù)3 次。 結(jié)論：通過響應(yīng)面分析建立的模型能很好地預(yù)測復(fù)方益母草口服液的提取效果，且建立的工藝穩(wěn)定可行，可為復(fù)方益母草口服液工藝改進提供參考。

關(guān)鍵詞復(fù)方益母草口服液；益母草；雞血藤；響應(yīng)面分析法；優(yōu)化；提取工藝；綜合評分法

中圖分類號：R284.2

文獻標(biāo)識碼：碼：A

文章編號：號：1007-5615(2015)03-0044-04

復(fù)方益母草口服液為我院自制制劑，由益母草和雞血藤兩味中藥組成，具有清熱涼血，活血調(diào)經(jīng)的功效，主治熱結(jié)血瘀所致的月經(jīng)過多，產(chǎn)后子宮出血，子宮復(fù)原不全，臨床使用十余年療效好且無明顯不良反應(yīng)。傳統(tǒng)一直依據(jù)經(jīng)驗采取煎煮法提取，為確定復(fù)方益母草口服液的最佳提取工藝，本實驗采用響應(yīng)面分析法[1-3]進行系統(tǒng)性研究。

1試藥與儀器

島津2501型紫外分光光度計，BP-211D型分析天平；益母草(批號：15012404)、雞血藤(批號：14111501)藥材飲片購自石家莊市柏林藥材加工廠，藥材質(zhì)量符合《中國藥典》2010版一部要求；鹽酸水蘇堿對照品(批號：110712-201209)由中國藥品生物制品檢定所提供；硫氰酸鉻銨由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；提取用水為飲用水，其它試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1鹽酸水蘇堿的測定

2.1.1測定方法：按照河北省醫(yī)療機構(gòu)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)JZBZ20090976-2012，采用紫外分光光度法測定鹽酸水蘇堿的含量，分別測定對照品、供試品和空白試劑溶液在520 nm處吸光度(0.1 mol/L鹽酸溶液為空白對照)，計算時用空白試劑的吸光度減去對照品或供試品溶液的吸光度。

2.1.2溶液的制備

2.1.2.1樣品提取液的制備：按處方比例(益母草︰雞血藤=2︰1)分別稱取益母草50 g，雞血藤25 g，按實驗設(shè)計的溶劑用量、提取次數(shù)和提取時間進行提取，過濾后濃縮至100 mL，備用。

2.1.2.2供試品溶液制備：精密量2.1.2.1項下樣品溶液10 mL，以0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至25 mL，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，加活性炭0.5 g，置沸水浴中加熱0.5 min，濾液精密加入新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3 mL，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至25 mL，搖勻；冰水浴1 h，濾過取續(xù)濾液測定吸光度。

2.1.2.3空白試劑溶液制備：精密量取0.1 mol/L鹽酸溶液20 mL，精密加入新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3 mL，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至25 mL，搖勻；冰水浴1 h，濾過取續(xù)濾液測定吸光度。

2.1.2.4對照品溶液制備：精密稱取鹽酸水蘇堿對照品(使用前105℃干燥至恒重)25 mg，置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備溶液(每1 mL含鹽酸水蘇堿1 mg)。精密量取上述對照品儲備溶液2.0、4.0、6.0、8.0 mL，以0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至25 mL，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，加活性炭0.5 g，置沸水浴中加熱0.5 min，濾液精密加入新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3 mL，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至25 mL，搖勻；冰水浴1 h，濾過取續(xù)濾液測定吸光度。

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制以吸光度的差值(△A，空白試劑的吸光度分別減去對照品的吸光度)為縱坐標(biāo)、鹽酸水蘇堿濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到鹽酸水蘇堿的含量回歸方程為：Y1=6.3705×△A+0.154

2.2提取液浸膏得率的測定[2]精密量取2.1.2.1項下樣品溶液20 mL，置蒸發(fā)皿中水浴蒸干，105℃干燥至恒重，計算，即得。

2.3綜合評分方法[4-5]綜合考慮鹽酸水蘇堿的質(zhì)量濃度 ( Y1︰mg /mL) 與浸膏得率 ( Y2︰g /mL)，上述兩項分別乘以不同權(quán)重系數(shù)0.7和0.3再相加即為綜合得分(Y =0.7Y1+0.3Y2)作為提取率的考察指標(biāo)。

2.4提取工藝單因素試驗

2.4.1溶劑用量:設(shè)定每次提取時間為60 min，提取次數(shù)為3次，改變加水量為藥材質(zhì)量的6倍、8倍、10倍、12倍，按供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液，考察溶劑用量對提取綜合得分的影響，綜合評分結(jié)果分別為 0.697、0.860、0.867、0.883，結(jié)果顯示加水量對綜合評分影響不大，但由于益母草和雞血藤屬草質(zhì)藥材，吸水量大，6倍水不足以使藥材充分浸泡，故選擇加水量為藥材質(zhì)量的8倍。

2.4.2提取次數(shù)：設(shè)定加水量為藥材質(zhì)量的8倍，提取時間60 min，改變提取次數(shù)為 1、2、3、4、5 次，按供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液，考察提取次數(shù)對提取綜合得分的影響，綜合評分結(jié)果分別為 0.373、0.537、0.825、0.865、0.869。表明隨著提取次數(shù)的增加綜合評分稱上升趨勢，但提取3次以上時，綜合得分提高很少，因此提取次數(shù)定為3次。

2.4.3提取時間：設(shè)定加水量為藥材質(zhì)量的 8 倍，提取次數(shù)為3次，改變提取時間為 30、60、90、120、180 min，按供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液，考察提取時間對提取綜合得分的影響，綜合評分結(jié)果分別為 0.395、0.853、1.035、1.044、1.026，結(jié)果提取時間為 90 min 基本提取完全， 90 min 之后綜合得分隨著時間的加長增高不明顯，提取180 min時甚至有略微下降。因此確定提取時間為90 min。

2.5提取工藝優(yōu)化試驗

2.5.1響應(yīng)面試驗及響應(yīng)值結(jié)果：在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定響應(yīng)面分析法試驗設(shè)計的因素為溶劑用量(A)、提取次數(shù)(B)、提取時間(C)，因素水平單位因素實驗中選取的最優(yōu)取值點及其上下區(qū)域各1個點，見表1。根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，以綜合得分為考察指標(biāo)，采用Design-Expert8.0統(tǒng)計軟件設(shè)計三因素三水平17個試驗點的響應(yīng)面分析，設(shè)計方案及綜合得分的響應(yīng)值見表2。

表1 復(fù)方益母草口服液提取工藝響應(yīng)面分析因素水平

編碼水平溶劑用量(A)提取次數(shù)(B)提取時間(C)-16260083901104120

表2復(fù)方益母草口服液提取工藝試驗設(shè)計及響應(yīng)值

編號ABCY163600.7002631200.849364900.919483901.0355102900.814683901.03871031201.035883901.037962900.7021084600.88411841201.0471283901.0371382600.54014104901.0371583901.03716821200.91617103600.867

2.5.2模型擬合及預(yù)測：通過Design-Expert 8.0軟件對響應(yīng)值與各因素編碼值進行回歸擬合，得到回歸方程如下: Y =-3.256+0.333×A+0.823×B+0.028×C+7.500×10-4AB+7.917×10-5×A×C- 1.775×10-3×B×C-0.0191×A2-0.092 ×B2-1.085×10-4×C2。模型方差分析結(jié)果見表3，見回歸模型極其顯著(<0.000 1)，另外在置信區(qū)間95%時，因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著 ( R = 0. 978)，說明建立的模型有意義；失擬項較小，說明模型擬合度良好，可以用方程計算數(shù)據(jù)對實驗結(jié)果進行分析和預(yù)測；模型的確定系數(shù)R2Adj為0.949，說明響應(yīng)值的變化有94.9%來源于所選自變量，即溶劑用量、提取次數(shù)和提取時間，模型方程各自變量方差分析表明，對提取響應(yīng)值影響最大的是方程一次項 A(溶劑用量) 、B(提取次數(shù))和C(提取時間)，其中B和C影響最大，方程二次項A2、B2、C2對提取響應(yīng)值也具有顯著性影響，但與一次項比較稍差，而交互項AB、AC對提取響應(yīng)值的影響不明顯，印證了復(fù)方益母草口服液工藝優(yōu)化模型中各因素并不是簡單的線性關(guān)系。

2.5.3響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化：根據(jù)回歸方程可繪制三維空間響應(yīng)曲面圖，因其只能同時反應(yīng)2個自變量及其交互作用對綜合得分的影響，[6]需固定溶劑用量、提取次數(shù)和提取時間其中1個因素。詳見圖1~圖3。

表3　復(fù)方益母草口服液提取工藝回歸模型與方差分析

圖1　提取次數(shù)和溶劑用量對綜合評分的影響

圖2　提取時間和溶劑用量對綜合評分的影響

圖3 提取時間和提取次數(shù)對綜合評分的影響

由響應(yīng)曲面圖可知，隨著提取次數(shù)的增加，綜合評分值也隨之增加，但當(dāng)提取次數(shù)增大到一定程度后，綜合評分值有下降的趨勢；隨著提取時間的增加，綜合評分值也隨之增加，但是當(dāng)提取時間增加到一定比例后綜合評分不再增加反而下降；溶劑用量對綜合評分值影響趨勢較上述兩者不明顯，這點由響應(yīng)曲面的陡峭程度也明顯可見，這與方差分析結(jié)果一致。

利用Design-Expert 8. 0統(tǒng)計軟件求解回歸方程得到，以綜合評分為指標(biāo)，復(fù)方益母草口服液的最佳提取工藝：溶劑用量為8.99倍水，提取次數(shù)3.501次，提取時間103.2 min，此時復(fù)方益母草口服液提取響應(yīng)值最高為1.106?？紤]到生產(chǎn)簡便易行和資源節(jié)約的原則，確定最佳提取工藝為加水倍數(shù)9倍，提取次數(shù)3次，提取時間100 min。

2.5.4 驗證試驗：按照篩選的優(yōu)化提取工藝制備樣品溶液3批，以鹽酸水蘇堿含量和浸膏得率計算綜合得分，復(fù)方益母草口服液提取響應(yīng)值為1.097(RSD=0.38%)，與理論預(yù)測值接近，該工藝穩(wěn)定、提取率理想。

3討論

優(yōu)化提取工藝的方法很多，常用的有單因素實驗、正交設(shè)計實驗、均勻設(shè)計實驗、析因設(shè)計實驗等，而響應(yīng)面分析法通過連續(xù)的實驗方法，建立實證模型，其得到的回歸方程精度高，并不是一種點對點單一的優(yōu)化方法，能夠?qū)?yōu)化過程延伸到面的程度，呈現(xiàn)立體效果，具有突出的優(yōu)越性，越來越廣泛的應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)藥、食品的多個領(lǐng)域。[7-8]

復(fù)方益母草口服液是由兩

本實驗通過單因素與響應(yīng)面結(jié)合的方法進行實驗，簡單易行，預(yù)測性良好，確定了最佳提取工藝，為工藝改進提供理論基礎(chǔ)。

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(2015-07-23收稿)