清熱抗毒煎劑對普通型手足口病患兒外周血Treg、Th17平衡的調節(jié)作用*

河北省石家莊市第五醫(yī)院

閻納新許尊貴楊莉李博柳曉金劉洪德鄭浩杰(石家莊 050021)

提要目的：研究清熱抗毒煎劑對普通型手足口病患兒外周血中Th17與調節(jié)性T細胞(Treg細胞)及相關細胞因子的水平的影響。 方法：采用流式細胞術檢測30例正常兒童及15名普通型手足口患兒外周血中(CD3+CD8-IL-17+)Th17及(CD4+CD25+Foxp3+)Treg細胞表達量，采用ELISA方法檢測血清中IL-6、IL-10、IL-17、IL-23、TGF-β1的水平。結果：普通型手足口患兒治療前與正常對照組相比，Treg細胞表達量、Treg/Th17比率及TGF-β1水平均明顯降低，Th17細胞表達量明顯升高(P值均<0.05)，IL-17、IL-6及IL-23有增高趨勢，IL-10有降低趨勢，但差異無顯著性(P>0.05)；治療后患兒體內Treg/Th17比率及TGF-β1水平與治療前相比均明顯升高，Th17細胞表達量明顯降低(P值均<0.05)，與正常對照組相比差異無顯著性( P>0.05)，IL-17、IL-6及IL-23有降低趨勢，IL-10有增高趨勢，但差異無顯著性(P>0.05)。結論：清熱抗毒煎劑可能通過抑制Th17細胞及其相關的細胞因子的產生，調整普通型手足口患兒體內Treg/Th17平衡紊亂，抑制體內炎癥的進展，這是其治療普通型手足口病機制之一。

關鍵詞手足口病；清熱抗毒煎劑；傳染??；腸道病毒；Treg細胞；Th17細胞；細胞因子

中圖分類號：R285.6

文獻標識碼：碼：A

文章編號：號：1007-5615(2015)03-0040-04

通訊作者：鄭浩杰，男，副主任醫(yī)師，碩士。

手足口病(HFMD)是由多種腸道病毒引起的常見傳染病，以嬰幼兒發(fā)病為主。HFMD的臨床表現輕重不一，輕者僅表現為自限性手足口病或皰疹性咽峽炎，為HFMD的普通型。近年研究顯示HFMD患者體內存在細胞免疫功能紊亂，[1]我們前期的研究證實CD4+T細胞的兩個新亞型輔助性T細胞17( Th17) 及調節(jié)性T細胞(Treg)所形成的Treg/Th17平衡失調在手足口病發(fā)病中發(fā)揮重要作用。[2]清熱抗毒煎劑為石家莊市第五醫(yī)院經驗方，具有清熱解毒瀉火，涼血祛濕的作用，臨床實踐表明對普通型手足口病治療效果顯著。本文對HFMD普通型患兒經清熱抗毒煎劑治療前后Treg細胞及Th17細胞的數量及其相關細胞因子的動態(tài)變化趨勢進行研究，探討清熱抗毒煎劑治療普通型手足口病的作用機制。

1材料與方法

1.1研究對象選擇2013年7月至2013年10月于石家莊市第五醫(yī)院住院治療的HFMD患兒15例，診斷標準均符合中華人民共和國衛(wèi)生部頒發(fā)的《手足口病診治指南(2010年版)》[3]普通型診斷標準，男8例，女7例，平均年齡1.96±0.67歲，表現為手、足、口、臀部出現皮疹，伴或不伴發(fā)熱，所選患兒經治療均痊愈出院，同時排除合并其他病毒與細菌感染，且入院前未接受任何治療。另外選擇同年齡健康兒童30例，作為正常對照組，其中男17例，女13例，平均1.52±0.73歲，2組兒童年齡之間差異無顯著性(P=0.097)，具有可比性。

*河北省中醫(yī)藥管理局資助項目：No 2011055

1.2試劑所用流式抗體均購自Biolegend公司，FOXP3 FIX/Prem Buffer Set、FOXP3&PERM Kit(破膜劑)、離子霉素、莫能菌素及佛波酯均購自Liankebio公司，所有檢測細胞因子的ELISA試劑盒均購自R&D公司，淋巴細胞分離液購自天津灝洋公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自GIBIC公司。

1.3治療方法普通型手足口患兒均給予基礎治療，包括給予水溶及脂溶性維生素及給予磷酸肌酸鈉針營養(yǎng)心肌治療，在此基礎上同時給予清熱抗毒煎劑口服治療，每次5 mL，每日3次(由石家莊市第五醫(yī)院制劑室提供)。清熱抗毒煎劑組成：生石膏、板藍根、升麻、藿香、蒲公英、黃連、白茅根。療程7 d。

1.4標本的采集于HFMD患兒入院第1天及治療第7天時，無菌采集肝素抗凝血2 mL，用于外周血Treg細胞及Th17細胞含量的檢測，同時采外周靜脈血1 mL，離心分離血清，-80℃冷凍保存，用于檢測細胞因子的含量，所有健康兒童同樣方式采集及保存標本。

1.5外周血Treg細胞表達量的檢測取100 μL抗凝全血加至流式管中，分別加入抗體CD4-PE、CD25-PC5各5 μL，混勻，室溫避光孵育15 min加入PBS 1 mL，1 500 rpm 離心5 min，棄上清；加入A液(破膜劑A)100 μL，室溫避光孵育 15 min，1 500 rpm 離心5 min，棄上清；加入Foxp3 Fix/Prem Buffe 3 mL，1 500 rpm離心5 min；加入B液(破膜劑B)100 μL及Foxp3 mAb-FITC10 ~20 μL，混勻，室溫孵育20 min，加入Foxp3 Fix/Prem Buffe 3 mL，1 500 rpm 離心5 min，棄上清；加入PBS 500 μL重懸細胞，上流式細胞儀檢測(CD4+CD25+Foxp3+)Treg細胞表達量。

1.6外周血Th17細胞表達量的檢測取抗凝全血2 mL，Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，用RPMI1640培養(yǎng)液調整PBMC密度為2×106個/mL， 將2 mL細胞懸液加入6孔板，同時加入佛波酯 100 ng/mL及離子霉素1 μg/mL進行刺激，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，加莫能菌素1 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，將培養(yǎng)的細胞2 000 rpm離心5 min，棄上清；加入1 mL PBS洗滌棄上清；再分別加入CD3-PC5、CD8-FITC抗體各5 μL，室溫避光孵育30 min；再次應用1 mL PBS洗滌，棄上清后加入Th17破膜劑A液100 μL，室溫避光15 min；再次應用1 mL PBS洗滌棄上清；加入B液100 μL并立即加入10 μL標記的鼠抗人IL-17-PE抗體，室溫避光孵育30 min；再次應用1 mL PBS洗滌棄上清，重復洗滌1次后，500 μL PBS重懸細胞，震蕩混勻，轉移至流式細胞儀專用管內，避光上流式細胞儀檢測(CD3+CD8-IL-17)Th17細胞表達量。

1.7外周血中細胞因子的檢測采用ELISA方法檢測普通型HFMD患兒及健康兒童血清中白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素10(IL-10)、白細胞介素17(IL-17)、白細胞介素23(IL-23)、人轉化生長因子-β1(TGF-β1)的含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.8統(tǒng)計學方法所有資料處理均用SPSSl3.0軟件包進行分析，檢測結果以±s表示，采用t檢驗比較各組間的差異，多組樣本均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)， P<0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1Treg細胞表達量的檢測普通型HFMD患兒在治療前、治療后的Treg細胞表達量與正常對照組相比均明顯降低，差異具有顯著性(P=0.001；0.006)，治療后與治療前相比有一定程度的升高，但是差異無顯著性(P=0.253)。結果見表1、圖1。

2.2Th17細胞表達量的檢測普通型HFMD患兒在治療前體內的Th17細胞表達量與正常對照組相比明顯升高，差異具有顯著性(P=0.016)，治療后體內的Th17細胞表達量與治療前相比明顯降低，差異具有顯著性(P=0.008)，與正常對照組相比差異不顯著(P=0.476)。結果見表1、圖2。

2.3各組Treg/Th17比值的比較普通型HFMD患兒治療前外周血中Treg/Th17比值與正常對照組相比明顯降低，差異具有非常顯著性(P=0.001)，而治療后Treg/Th17比值與治療前相比明顯升高，差異具有顯著性(P=0.010)，與正常對照組相比差異無顯著性(P=0.333)。結果詳見表1。

表1　各組Treg細胞及Th17細胞表達量　()±s)

表1　各組Treg細胞及Th17細胞表達量　()±s)

組別時間例數Treg細胞(%)Th17細胞(%)Treg/Th17正常對照組306.55±3.78 0.27±0.22 32.78±20.79 普通型HFMD組治療前152.41±2.17▲0.47±0.41▲7.07±6.77▲治療后153.74±2.39▲0.21±0.14★26.60±26.14★F9.8424.3918.359P0.0010.0170.001

注：與治療前相比 ， ★P<0.05； 與正常對照組相比，▲P<0.05

圖1(CD4+CD25+Foxp3+)Treg細胞流式細胞術檢測示意圖

圖2(CD3+CD8-IL-17+)Th17細胞流式細胞術檢測示意圖

2.4各組血清細胞因子含量的比較普通型HFMD患兒血清IL-6、IL-17及IL-23治療前的含量與正常對照組相比差異不大，IL-6、IL-17有一定程度增高，而治療后這3種細胞因子含量則低于正常對照組，但是差異不顯著(F=0.319、1.759、1.688，P=0.728、0.181、0.194)；普通型HFMD患兒血清IL-10的含量在治療前、治療后與正常對照組相比均有一定程度的降低，治療后比治療前有一定升高，只是3組之間差異不顯著(F=1.526，P=0.226)；普通型HFMD患兒血清TGF-β1的含量治療前與正常對照組相比明顯降低，差異具有顯著性(P=0.001)，而治療后與治療前相比明顯升高，差異具有顯著性(P=0.006)，與正常對照組相比則差異不顯著(P=0.556)。結果詳見表2。

表2各組血清細胞因子的含量

(pg/mL)

注：與治療前組相比，★P<0.05； 與正常對照組相比， ▲P<0.05

3討論

HFMD是小兒常見的由腸道病毒引起的急性傳染病，具有傳染性強、傳播途徑廣、病情發(fā)展迅速等特點，臨床以手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹及發(fā)熱為主要表現。根據病情分為普通型和重癥，其中絕大部分病例為普通型，少數病例為重癥，目前手足口病沒有特殊的治療方法，多采用對癥治療。[4]我院根據本病形成的病因病機特點，研制出清熱抗毒煎劑中藥方劑，臨床實踐表明清熱抗毒煎劑治療手足口病普通型安全有效，有明顯的退熱、促進皰疹和(或)皮疹消退、減輕癥狀、縮短病程等綜合療效。目前人們已注意到HFMD患兒體內存在細胞免疫功能紊亂，[1-2，5]而中藥對免疫系統(tǒng)的調節(jié)作用成為近年研究的熱點。既往人們已經認識到Th1/Th2平衡維持肌體的免疫功能穩(wěn)定的重要性，近年來發(fā)現Treg/Th17平衡在肌體免疫中也發(fā)揮著重要作用，是對Th1和Th2免疫平衡理論的重要補充。Treg和Th17在肌體中的作用是相反的，Treg是CD4+T淋巴細胞，為一類具有免疫抑制作用的T細胞，在調節(jié)免疫反應過程中發(fā)揮著關鍵作用，Thl7細胞在自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，以高分泌IL-17為特征，具有強大的促炎效應。[2]在本研究中可見普通型HFMD患兒體內Treg細胞明顯減少，Th17細胞明顯增多，Treg/Th17比值明顯降低，顯示患兒體內存在Treg/Th17平衡紊亂，這與我們以前的研究結果基本一致，[2]而患兒經清熱抗毒煎劑治療后，Treg細胞有一定程度的增高，但與治療前比差異不顯著，Th17細胞則明顯減低，因此致使Treg/Th17比值明顯回升，與治療前相比差異顯著，與正常對照組相比差異無顯著性，提示清熱抗毒煎劑主要抑制Th17細胞的生成，調節(jié)Treg細胞和Th17細胞之間的平衡，使Treg/Th17平衡紊亂得到恢復。

Treg 與 Th17 由同一種前體細胞分化而來，它們的分化途徑具有互逆性，未分化的Th細胞在不同細胞因子的作用下向著不同的方向分化，Th17與Treg之間的關系與 TGF-β 密切相關，研究表明，低濃度的 TGF-β與 IL-6 協(xié)同作用可促進Th17 的生成，而高濃度的 TGF-β 則能促進Foxp3 的表達，促進 CD4+T 細胞向 Treg 方向分化。[6]在本研究結果可以看出治療前IL-6與正常對照組相比有所增高，而TGF-β1與正常對照組相比明顯降低，且差異有顯著性，而治療后TGF-β1明顯升高，與正常對照組比差異不大，而IL-6則呈降低趨勢，甚至低于正常對照組，可見治療前患兒體內細胞因子的濃度是趨向促進向Th17細胞分化，經清熱抗毒煎劑治療后，患兒體內的細胞因子作用是促進向Treg的分化，而抑制Th17的生成，由此可見清熱抗毒煎劑具有調節(jié)Treg 與 Th17的分化的功能。

Treg細胞和Th17細胞的功能發(fā)揮通過肌體多種細胞因子進行調節(jié)。Treg 通過分泌 IL-4、IL-10 和TGF-β，參與自身免疫性疾病、移植免疫、腫瘤免疫等。[7]IL-10和TGF-β1為抗炎性細胞因子，本研究中顯示患兒體內IL-10、TGF-β1的含量在治療前與正常對照組相比降低，治療后比治療前增高，只是IL-10的含量差異不顯著，TGF-β1的含量則是差異具有顯著性，由此可見清熱抗毒煎劑通過促進這兩種細胞因子的產生而增強Treg細胞對炎癥反應的抑制作用。Thl7作為一種炎性細胞，主要通過分泌IL-17等促炎因子參與炎性疾病的發(fā)生發(fā)展。[8]IL-6、IL-17為促炎因子，IL-17 與IL-6 共同促進骨髓內中性粒細胞的分化及向炎癥部位募集，激發(fā)炎癥反應。[9]從本研究可以看出在治療前患兒血清內IL-17、IL-6均比正常對照組增多，治療后則含量下降，甚至比正常對照組還低，雖然差異不顯著，但是這兩種細胞因子還是呈降低趨勢。IL-23具有維持和擴大Th17的功能，促進IL-17的產生，[10]本研究結果亦顯示患兒治療后血清內IL-23的含量與治療前相比有所降低，雖然差異不顯著，但是呈降低趨勢，可見清熱抗毒煎劑通過抑制IL-17、IL-6、IL-23與Th17相關細胞因子的產生，進一步抑制Th17細胞的功能。

總之，從本研究結果顯示清熱抗毒煎劑可能通過抑制Th17細胞及其相關的細胞因子的產生，調整普通型手足口患兒體內Treg/Th17平衡紊亂，抑制體內炎癥的進展，這可能是其治療普通型手足口病的機制之一。本研究收集HFMD患兒病例較少，還需增大樣本進一步驗證清熱抗毒煎劑的作用機制。

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(2015-05-03收稿)