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基于斑馬魚模型探討豬牙皂皂苷類藥物急性毒性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系

陳麗曉1，何明芳2，高曉平2，蔣玲玲2，殷志琦3，濮存海1*

(1.南京師范大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院藥物制劑研究室，南京 210023；2.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，南京 210009；3.中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，南京 210009)

[關(guān)鍵詞]豬牙皂皂苷；急性毒性；化學(xué)結(jié)構(gòu)；斑馬魚

豬牙皂(Gleditsiae Fructus Abnormalis)是豆科皂莢屬植物皂莢(GleditsiasinensisLam.)的干燥不育果實(shí)，收載于2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》，具有祛痰開(kāi)竅，散結(jié)消腫的功效，主要成分為三萜皂苷[1]。近年來(lái)的研究表明，這些皂苷具有抗血管新生[2，3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]等藥理作用。但尚未有關(guān)于豬牙皂三萜皂苷的急性毒性研究的報(bào)道。

斑馬魚(Daniorerio)是分布于孟加拉國(guó)、印度、巴基斯坦等國(guó)家水域的一種小型熱帶魚，是研究發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)等學(xué)科的一種模式動(dòng)物。斑馬魚和人類之間的基因同源性高達(dá)85%。斑馬魚養(yǎng)殖方便、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、體外受精、胚胎透明，不僅具有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)高通量的優(yōu)勢(shì)，還具有類似于哺乳動(dòng)物的完整生物體，是一種非常靈敏的藥物毒性評(píng)價(jià)模型，因此非常適合用于藥物研發(fā)早期的毒性評(píng)價(jià)。

作者在成功運(yùn)用斑馬魚模型評(píng)估小分子毒性的基礎(chǔ)上[6]，對(duì)豬牙皂中的7種三萜皂苷的毒性進(jìn)行研究，并比較了它們的毒性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。

1材料

1.1斑馬魚斑馬魚野生型成魚由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所趙慶順教授提供 (實(shí)驗(yàn)室自行繁殖建系)， 品系為tubingen。

1.2藥物豬牙皂藥材產(chǎn)地為安徽，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)秦民堅(jiān)教授鑒定為豬牙皂(Gleditisiae Fructus Abnormalis)，標(biāo)本(No. 20100401)保存于江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。7種豬牙皂皂苷分離自豬牙皂，經(jīng)過(guò)柱層析及重結(jié)晶和制備色譜等純化手段得到單體，由中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室殷志琦教授課題組提供，其結(jié)構(gòu)經(jīng)波譜鑒定，與文獻(xiàn)[7，8]一致。它們的名稱、分子式和相對(duì)分子質(zhì)量見(jiàn)表1，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

1.3儀器和試劑恒溫培養(yǎng)箱(南京楚強(qiáng)科學(xué)儀器公司)；SMZ645體視顯微鏡(日本Nikon公司)。二甲亞砜(DMSO, Sigma-Aldrich公司)；海鹽(美國(guó)Instant Ocean公司)。

表1　7種豬牙皂皂苷的分子式和相對(duì)分子質(zhì)量

圖1　7種豬牙皂皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2方法和結(jié)果

2.1急性毒性實(shí)驗(yàn)取受精后72 h的斑馬魚魚卵，加入24孔板中，20條/孔，每孔含1 ml 0.2 g/L 的海鹽水。7種皂苷分別用DMSO溶解，配成不同加藥濃度(見(jiàn)表2)，每孔加入1 μl藥物，放在28.5 ℃的恒溫箱中孵育24 h，在體視顯微鏡下觀察每孔魚卵的死亡情況，以心臟停止跳動(dòng)判斷為死亡。記錄每個(gè)加藥組的死亡魚卵數(shù)，并計(jì)算該加藥組的死亡率。藥物作用期間不喂食，如果發(fā)現(xiàn)有死亡魚卵及時(shí)撈出。采用GraphPad Prism 5軟件計(jì)算各藥物的半數(shù)致死濃度(LC50)值。結(jié)果表明，gleditsia saponins C′和gleditsiosides H在最高濃度500 μmol/L時(shí)，都沒(méi)有造成魚卵的死亡，其余皂苷的毒性呈明顯的劑量依賴性(見(jiàn)圖2)。由于皂苷結(jié)構(gòu)的多樣性，導(dǎo)致對(duì)斑馬魚卵急性毒性的巨大差異(見(jiàn)表2)。

表2　7種豬牙皂皂苷類化合物的

LC50：半數(shù)致死濃度

圖2　7種豬牙皂皂苷類化合物的濃度與斑馬魚魚卵死亡率的曲線圖A:gleditsiosides A;B:gleditsia saponins C′;C:gleditsiosides D;D:gleditsiosides F;E:gleditsiosides H;F:gleditsiosides I;G:gleditsiosides Q

2.2豬牙皂皂苷類化合物結(jié)構(gòu)與毒性關(guān)系研究由上述豬牙皂皂苷類化合物的結(jié)構(gòu)與急性毒性的數(shù)據(jù)，推斷出以下結(jié)構(gòu)與毒性關(guān)系：(1)gleditsiosides I、H和gleditsia saponins C′3個(gè)化合物的急性毒性小，推斷出單萜結(jié)構(gòu)單元的存在是產(chǎn)生毒性的關(guān)鍵基團(tuán)；(2)比較gleditsiosides H和gleditsia saponins C′，結(jié)構(gòu)中均沒(méi)有單萜單元的存在，后者16位碳上有羥基，說(shuō)明16位碳上的羥基并不影響化合物的毒性大?。?3)結(jié)構(gòu)中有單萜結(jié)構(gòu)單元的化合物gleditsiosides A、D、F和Q中，gleditsiosides D的毒性最強(qiáng)，說(shuō)明除了單萜結(jié)構(gòu)單元，半乳糖結(jié)構(gòu)的引入使皂苷的毒性增加10倍多。而gleditsiosides F中有兩個(gè)單萜結(jié)構(gòu)單元，但是并沒(méi)有顯著增加皂苷的毒性。對(duì)比gleditsiosides A和Q，發(fā)現(xiàn)單萜單元中的酯鍵α位的取代基差異對(duì)皂苷毒性影響不大；同時(shí)，16位羥基的取代與否，對(duì)皂苷的毒性影響也不大。

3討論

本研究利用整體動(dòng)物模型斑馬魚，對(duì)7種豬牙皂皂苷類化合物的急性毒性進(jìn)行研究，并總結(jié)出了結(jié)構(gòu)與毒性之間的關(guān)系。果德安課題組早在2004年就對(duì)豬牙皂皂苷的結(jié)構(gòu)與它們對(duì)6種不同腫瘤細(xì)胞株殺傷效果的關(guān)系進(jìn)行過(guò)討論[9]，發(fā)現(xiàn)不同化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性強(qiáng)弱不同，而同一個(gè)化合物對(duì)6種不同腫瘤細(xì)胞株的毒性強(qiáng)弱也不同。為了探討構(gòu)效關(guān)系，上述課題組主要采用HL-60細(xì)胞株的結(jié)果為主要依據(jù)來(lái)闡述。本研究采用了斑馬魚整體動(dòng)物模型來(lái)探討結(jié)構(gòu)與毒性之間的關(guān)系，與體外細(xì)胞株相比較，斑馬魚模型更加貼近化合物對(duì)完整的生命體產(chǎn)生的毒性。

本研究發(fā)現(xiàn)，單萜的引入能極大地增加豬牙皂皂苷的毒性；在具有單萜結(jié)構(gòu)的前提下，半乳糖的引入也能增加豬牙皂皂苷的毒性，這與果德安課題組在體外腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中得出的豬牙皂細(xì)胞毒性的結(jié)論是一致的。這也說(shuō)明，在抗腫瘤藥物的研發(fā)過(guò)程中，體外篩選出的強(qiáng)效細(xì)胞毒性化合物可能具有潛在的毒性，必須盡早配合毒性實(shí)驗(yàn)，才能全面地評(píng)價(jià)化合物的后續(xù)研發(fā)潛力。

由本研究得出的毒性以及毒性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，作者認(rèn)為豬牙皂皂苷對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性正好也是該類化合物對(duì)正常組織和器官的毒性，因此后續(xù)開(kāi)發(fā)希望其成為抗腫瘤藥物時(shí)，需要特別關(guān)注其毒理。

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[修回日期]2015-11-23

[本文編輯]陽(yáng)凌燕

·技術(shù)和方法·

[收稿日期]2014-10-28

通信作者*(Corresponding author)：濮存海，E-mail：pucunhai@163.com

作者簡(jiǎn)介陳麗曉(女),碩士生. E-mail：lxchen8912@163.com

DOI：10.5428/pcar20150620

[中圖分類號(hào)]R994.39

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]B

[文章編號(hào)]1671-2838(2015)06-0466-03