黃聲雷，　胡必杰，　陳　蓉，　周春妹

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科，上海 200032；2.上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126)

摘要：目的　評(píng)價(jià)2種基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)系統(tǒng)(Autoflex MALDI-TOF MS和Vitek MALDI-TOF MS)在快速鑒定血培養(yǎng)中分離的白念珠菌以外酵母樣真菌的應(yīng)用。方法　收集復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院2010年10月至2013年1月住院患者血培養(yǎng)中分離的白念珠菌以外酵母樣真菌59株，以真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)測(cè)序鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較Autoflex MALDI-TOF MS、Vitek MALDI-TOF MS和API 20C AUX 3種系統(tǒng)鑒定的準(zhǔn)確性。結(jié)果　59株菌株包含了11種真菌，其中近平滑復(fù)合體30株(占50.8%)、熱帶念珠菌11株(占18.6%)、光滑念珠菌8株(占13.6%)、克柔念珠菌2株(占3.4%)、新生隱球菌2株(占3.4%)、異常威克漢姆酵母2株(占3.4%)、季也蒙念珠菌復(fù)合體1株(占1.7%)、葡萄牙念珠菌1株(占1.7%)、阿薩希毛孢子菌1株(占1.7%)和釀酒酵母1株(占1.7%)。3種系統(tǒng)鑒定真菌總的準(zhǔn)確性分別為Autoflex MALDI-TOF MS 93.2%、Vitek MALDI-TOF MS 83.1%和API 20C AUX 79.7%,2種MALDI-TOF MS比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.155)。其中對(duì)白念珠菌以外酵母樣真菌的鑒定準(zhǔn)確性分別為Autoflex MALDI-TOF MS 100.0%、Vitek MALDI-TOF MS 84.9%和API 20C AUX 84.9%，2種MALDI-TOF MS比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。對(duì)念珠菌屬外的少見真菌鑒定準(zhǔn)確性分別為Autoflex MALDI-TOF MS 33.3%、Vitek MALDI-TOF MS 66.6%和API 20C AUX 33.3%。結(jié)論　MALDI-TOF MS系統(tǒng)和目前常規(guī)生化鑒定方法相比，具有快速、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)；對(duì)于臨床血培養(yǎng)分離真菌的鑒定，Autoflex MALDI-TOF MS鑒定準(zhǔn)確性和Vitek MALDI-TOF MS相似，但對(duì)常見非白念珠菌的鑒定，Autoflex MALDI-TOF MS鑒定準(zhǔn)確性優(yōu)于Vitek MALDI-TOF MS。

關(guān)鍵詞：基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；非白念珠菌；血培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：

兩種MALDI-TOF MS系統(tǒng)快速鑒定血培養(yǎng)中白念珠菌以外酵母樣真菌

黃聲雷1，胡必杰1，陳蓉2，周春妹1

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科，上海 200032；2.上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126)

摘要：目的評(píng)價(jià)2種基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)系統(tǒng)(Autoflex MALDI-TOF MS和Vitek MALDI-TOF MS)在快速鑒定血培養(yǎng)中分離的白念珠菌以外酵母樣真菌的應(yīng)用。方法收集復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院2010年10月至2013年1月住院患者血培養(yǎng)中分離的白念珠菌以外酵母樣真菌59株，以真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)測(cè)序鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較Autoflex MALDI-TOF MS、Vitek MALDI-TOF MS和API 20C AUX 3種系統(tǒng)鑒定的準(zhǔn)確性。結(jié)果59株菌株包含了11種真菌，其中近平滑復(fù)合體30株(占50.8%)、熱帶念珠菌11株(占18.6%)、光滑念珠菌8株(占13.6%)、克柔念珠菌2株(占3.4%)、新生隱球菌2株(占3.4%)、異常威克漢姆酵母2株(占3.4%)、季也蒙念珠菌復(fù)合體1株(占1.7%)、葡萄牙念珠菌1株(占1.7%)、阿薩希毛孢子菌1株(占1.7%)和釀酒酵母1株(占1.7%)。3種系統(tǒng)鑒定真菌總的準(zhǔn)確性分別為Autoflex MALDI-TOF MS 93.2%、Vitek MALDI-TOF MS 83.1%和API 20C AUX 79.7%,2種MALDI-TOF MS比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.155)。其中對(duì)白念珠菌以外酵母樣真菌的鑒定準(zhǔn)確性分別為Autoflex MALDI-TOF MS 100.0%、Vitek MALDI-TOF MS 84.9%和API 20C AUX 84.9%，2種MALDI-TOF MS比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。對(duì)念珠菌屬外的少見真菌鑒定準(zhǔn)確性分別為Autoflex MALDI-TOF MS 33.3%、Vitek MALDI-TOF MS 66.6%和API 20C AUX 33.3%。結(jié)論MALDI-TOF MS系統(tǒng)和目前常規(guī)生化鑒定方法相比，具有快速、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)；對(duì)于臨床血培養(yǎng)分離真菌的鑒定，Autoflex MALDI-TOF MS鑒定準(zhǔn)確性和Vitek MALDI-TOF MS相似，但對(duì)常見非白念珠菌的鑒定，Autoflex MALDI-TOF MS鑒定準(zhǔn)確性優(yōu)于Vitek MALDI-TOF MS。

關(guān)鍵詞：基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；非白念珠菌；血培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)02-0128-04R446.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.006

作者簡(jiǎn)介：黃聲雷，男，1978年生，學(xué)士，主管技師，主要從事細(xì)菌和真菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及耐藥機(jī)制研究。

通訊作者：胡必杰， 聯(lián)系電話：021-64041990。

Abstract:ObjectiveTo evaluate the application of 2 matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), Autoflex MALDI-TOF MS and Vitek MALDI-TOF MS, for the identification of Yeast like fungi outside of Candida albicans isolated from blood culture. MethodsA total of 59 isolates were collected from blood culture from October 2010 to February 2013 among inpatients in Zhongshan Hospital, Fudan University. The results of fungus internal transcribed spacer (ITS) sequencing were as golden standards. The correct identification rates of Autoflex MALDI-TOF MS, Vitek MALDI-TOF MS and API 20C AUX were analyzed comparatively. ResultsThe 59 isolates included 11 types of fungi, namely, Candida parapsilosis complex(30 isolates, 50.8%), Candida tropicalis(11 isolates, 18.6%), Candida glabrata(8 isolates, 13.6%), Candida krusei( 2 isolates, 3.4%), Wickerhamomy cesanomalus(2 isolates, 3.4%), Cryptococcus neoformans(2 isolates, 3.4%), Candida iusitaniae(1 isolate, 1.7%), Candida guilliermondii (1 isolate, 1.7%), Trichosporon asahii(1 isolate, 1.7%) and Saccharomyces cerevisiae (1 isolate, 1.7%). The correct identification rates by Autoflex MALDI-TOF MS, Vitek MALDI-TOF MS and API 20C AUX were 93.2%, 83.1% and 79.7%, respectively, and there was no statistical significance between the 2 MALDI-TOF MS systems (P=0.155). The correct identification rates for yeast like fungi outside of Candida albicans by Autoflex MALDI-TOF MS, Vitek MALDI-TOF MS and API 20C AUX were 100.0%, 84.9% and 84.9%, respectively, and there was statistical significance between the 2 MALDI-TOF MS systems(P=0.006). The correct identification rates of rarely clinical encountered fungi by Autoflex MALDI-TOF MS, Vitek MALDI-TOF MS and API 20C AUX were 33.3%, 66.6% and 33.3%, respectively. ConclusionsMALDI-TOF MS system is rapid, simple and accurate compared with current routine biochemical identification methods. The performance of Autoflex MALDI-TOF MS is similar with that of Vitek MALDI-TOF MS for the identification of isolated fungi from blood culture. The performance of Autoflex MALDI-TOF MS is better than that of Vitek MALDI-TOF MS for the identification of yeast like fungi outside of Candida albicans.

收稿日期：(2014-11-10)

Rapid identification of Yeast like fungi outside ofCandidaalbicansisolated form blood culture by two MALDI-TOF MS systemsHUANGShenglei1,HUBijie1,CHENRong2,ZHOUChunmei1.(1.DepartmentofRespiratory,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 2.ShanghaiCentreforClinicalLaboratory,Shanghai200126,China)

Key words: Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry; Non-Candidaalbicans; Blood culture

隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，念珠菌血癥的發(fā)生率在過去10年中已上升了5倍[1]。在美國(guó)，念珠菌已成為院內(nèi)血流感染第4位的常見病原菌[2]。有研究顯示非白念珠菌在念珠菌血癥的分離率和對(duì)抗真菌藥物的耐藥率正逐年上升[3]。因此，念珠菌血癥早期診斷對(duì)患者預(yù)后十分重要。但目前臨床微生物實(shí)驗(yàn)室使用的傳統(tǒng)表型生化方法鑒定菌株需要24～48 h，且準(zhǔn)確性不高。使用分子生物學(xué)方法如聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)等方法鑒定，費(fèi)用昂貴，對(duì)操作人員技術(shù)要求高，不能成為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的檢測(cè)方法?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是近幾年發(fā)展起來的基于微生物蛋白指紋圖譜鑒定病原菌的方法,具有快速、準(zhǔn)確、靈敏和分辨率高等特點(diǎn)。本研究分析、比較2種不同的MALDI-TOF MS系統(tǒng)以及傳統(tǒng)鑒定方法鑒定血培養(yǎng)中白念珠菌以外酵母樣真菌的鑒定效果。

材料和方法

一、菌株來源

收集2010年10月至2013年1月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院住院患者血培養(yǎng)分離到的59株白念珠菌以外酵母樣真菌。所有菌株在SDA(自配干粉購(gòu)自O(shè)ixid公司)培養(yǎng)基分純，30 ℃培養(yǎng)24 h后備用。

二、方法

1.API 20C AUX 板條鑒定挑取新鮮菌落制成2麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，吸?00 μL菌懸液轉(zhuǎn)入API 20C培養(yǎng)基安瓿內(nèi)，然后將安瓿內(nèi)的懸浮液注入AUC板條的杯內(nèi)，30 ℃孵育48～72 h，讀取鑒定結(jié)果。

2.Autoflex MALDI-TOF MS鑒定根據(jù)Bruker Dahonics公司提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，先挑取新鮮菌落于500 μL無菌高效液相色譜級(jí)水，18 759×g離心2 min，棄上清液。加入1.2 mL 70%乙醇混勻，18 759×g離心2 min棄上清。加入20 μL 70%蟻酸全速混勻10 min。再加入20 μL 100%乙腈，全速混勻10 min。18 759×g離心2 min后，取上清液用于MALDI-TOF MS分析。取1 μL上清液在MALDI-TOF靶板上點(diǎn)樣，待樣本干燥后，取1 μL基質(zhì)液(50%乙腈和2.5%三氟乙酸的α-氰基-4-羥基肉桂酸飽和溶液)覆蓋于樣本上。樣本和基質(zhì)液均勻干燥，將靶板放入MALDI-TOF MS儀，儀器設(shè)定如下：正線性模式，激光頻率60 Hz，加速電壓20 kV，離子源加速電壓16.7 kV、170 BS離子延時(shí)引出。每個(gè)樣本重復(fù)采樣500次，如未獲合格的圖譜則追加100次，直至總數(shù)達(dá)到1 000次。質(zhì)譜區(qū)間設(shè)定的質(zhì)荷比(m/z)為2 000～20 000區(qū)域，波峰的信號(hào)強(qiáng)度必須>0.07。蛋白校準(zhǔn)品(大腸埃希菌DH5a蛋白抽提物，由德國(guó)Bruker Daltonics公司提供)單獨(dú)點(diǎn)樣作為陽性對(duì)照，基質(zhì)液為陰性對(duì)照。質(zhì)譜分析：Autoflex MALDI-TOF MS分光計(jì)和Flexcontrol 3.0軟件相結(jié)合獲取和分析樣本質(zhì)譜，應(yīng)用MALDI Biotyper 3.0軟件將樣本的質(zhì)譜圖與Bruker Daltonics標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。鑒定分值分為0～3，其中2.000～3.000表示可鑒定到菌種，1.700～1.999表示鑒定到屬，0.000～1.699表示不能可靠鑒定。

3.Vitek MALDI-TOF MS鑒定根據(jù)Vitek MALDI-TOF MS標(biāo)準(zhǔn)操作流程，用1 μL定量接種環(huán)直接挑取新鮮菌落涂在靶板點(diǎn)位內(nèi)，先加0.5 μL Vitek MALDI-TOF MS FA試劑待干燥，再將標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 8739(由法國(guó)生物梅里埃公司提供)涂在靶板的校準(zhǔn)點(diǎn)位中，所有檢測(cè)位點(diǎn)加入1 μL Vitek MS-α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)液，待干燥后放入MALDI-TOF MS儀器獲取細(xì)菌全細(xì)胞蛋白質(zhì)譜，然后將待測(cè)菌質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫(kù)(MS-IVD數(shù)據(jù)庫(kù)V2.0版本)已知菌質(zhì)譜進(jìn)行比較、分析從而獲得鑒定結(jié)果。Vitek MALDI-TOF MS結(jié)果分為3種顏色：綠色表示唯一的鑒定結(jié)果，可信概率(60.0%～99.9%)；黃色表示低分辨率結(jié)果，可信概率(>60.0%)需要進(jìn)一步做補(bǔ)充試驗(yàn)才能確定；紅色表示不能鑒定，可信概率(<60.0%)與數(shù)據(jù)庫(kù)的任何質(zhì)譜不匹配[4]。

4.真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列分析細(xì)菌DNA通過酵母基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自TIANGEN公司)提取，PCR擴(kuò)增引物、反應(yīng)條件及反應(yīng)體系見文獻(xiàn)[5]。擴(kuò)增引物序列為ITS3(5′-GCATATCAATAAGC-GGAGGA-3′)和ITS4(5′-GCATCGATGAAGAAC-GCAGC-3′)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交與北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后獲得的序列在BLAST網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行在線比對(duì)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，選用Fisher Exact Test檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

59株真菌經(jīng)ITS序列分析鑒定，念珠菌屬53株，新生隱球菌2株，異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)2株，阿薩希毛孢子菌和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)各1株。其中47株經(jīng)3種系統(tǒng)鑒定結(jié)果一致，包括近平滑念珠菌22株，熱帶念珠菌11株，光滑念珠菌8株，克柔念珠菌2株，新生隱球菌2株，季也蒙念珠菌1株和葡萄牙念珠菌1株，見表1。有12株鑒定結(jié)果不一致，見表2。以ITS序列測(cè)序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，3種系統(tǒng)鑒定真菌的準(zhǔn)確性分別為：Autoflex MALDI-TOF MS 93.2%，Vitek MALDI-TOF MS 83.1%和API 20C AUX 79.7%， 2種MALDI-TOF MS比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.155)。對(duì)白念珠菌以外酵母樣真菌的鑒定準(zhǔn)確性分別為Autoflex MALDI-TOF MS 100.0%，Vitek MALDI-TOF MS 84.9%和API 20C AUX 84.9%,2種MALDI-TOF MS比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。其中98.1%念珠菌屬Autoflex MALDI-TOF MS的鑒定值>2.000，只有1株克柔念珠菌的鑒定值為1.979。由于Vitek MALDI-TOF MS的IVD2.0數(shù)據(jù)庫(kù)和API 20C AUX菌種庫(kù)內(nèi)沒有包括近平滑念珠菌復(fù)合體的其它亞種(Candidametapsilosis和Candidaorthopsilosis)，故不能區(qū)分“Candidametapsilosis”。3種系統(tǒng)對(duì)念珠菌屬外的少見真菌(新生隱球菌、異常威克漢姆酵母、阿薩希毛孢子和釀酒酵母)鑒定準(zhǔn)確性分別為Autoflex MALDI-TOF MS 33.3%、Vitek MALDI-TOF MS 66.6%和API 20C AUX 33.3%。

表1　3種系統(tǒng)對(duì)59株白念珠菌以外酵母樣真菌鑒定的結(jié)果

表2　3種系統(tǒng)對(duì)12株白念珠菌以外酵母樣真菌鑒定不一致的結(jié)果

討論

絕大多數(shù)的侵襲性念珠菌血癥是由白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌和克柔念珠菌引起[6]。 根據(jù)報(bào)陽血培養(yǎng)的涂片結(jié)果，使用Chromagar顯色培養(yǎng)基能較好地分離和鑒定白念珠菌，其準(zhǔn)確性>95%。但是對(duì)那些不顯色的非白念珠菌如近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌和葡萄牙念珠菌等，顯色培養(yǎng)基無法鑒定到種。目前國(guó)內(nèi)臨床微生物室所使用其它系統(tǒng)如API 20C AUX對(duì)非白念珠菌的鑒定一般需要18～70 h左右，時(shí)間較長(zhǎng)，并且需要接種米飯培養(yǎng)基等。全自動(dòng)微生物鑒定儀雖然操作較為簡(jiǎn)便，但也需要16～18 h，且影響因素較多，如果不能鑒定，只能重新操作或選擇其它鑒定方法。隨著近幾年血培養(yǎng)中非白念珠菌分離率、耐藥率的提高及非白念珠菌血癥病死率的上升，傳統(tǒng)鑒定的方法已經(jīng)不能滿足臨床醫(yī)生及時(shí)準(zhǔn)確診斷侵襲性非白念珠菌血癥的需求。

近年隨著對(duì)細(xì)菌蛋白提取和解析技術(shù)的發(fā)展，MALDI-TOF MS作為一種新技術(shù)，通過提取分析某種微生物特定表型或基因型特征性的生物標(biāo)志物，利用已有蛋白質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息對(duì)微生物進(jìn)行的種屬鑒定，已經(jīng)在臨床得到越來越多的運(yùn)用。

本次研究比較目前國(guó)際上2家主流的MALDI-TOF MS鑒定系統(tǒng)(Autoflex MALDI-TOF MS和Vitek MALDI-TOF MS)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種MALDI-TOF MS結(jié)果對(duì)血培養(yǎng)常見真菌的鑒定準(zhǔn)確性非常接近(P>0.05)。但是由于Vitek MALDI-TOF MS系統(tǒng)使用的IVD2.0數(shù)據(jù)庫(kù)沒有包含近平滑念珠菌復(fù)合體的其它亞種和季也蒙念珠菌復(fù)合體其他亞種的數(shù)據(jù)。因此，對(duì)于臨床血培養(yǎng)常見的非白念珠菌，Vitek MALDI-TOF MS鑒定準(zhǔn)確性遜色于Autoflex MALDI-TOF MS(P<0.01)，這和臺(tái)灣CHAO等[7]報(bào)道的結(jié)果相似。對(duì)于少見酵母菌鑒定的準(zhǔn)確性，由于本次試驗(yàn)菌株數(shù)量較少，不能做出準(zhǔn)確的評(píng)估，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。使用Vitek MALDI-TOF MS鑒定真菌，從靶板樣本制備到檢測(cè)完畢大約30 min，而且一次性能夠檢測(cè)48株菌，而Autoflex MALDI-TOF MS由于需要溶菌提取真菌蛋白，其操作比Vitek MALDI-TOF MS繁瑣、耗時(shí)。但2種MALDI-TOF MS鑒定系統(tǒng)均比API系統(tǒng)省時(shí)。

綜上所述，MALDI-TOF MS鑒定系統(tǒng)和目前常規(guī)生化方法相比，對(duì)多數(shù)酵母菌的鑒定具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是對(duì)傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法的補(bǔ)充，為真菌鑒定提供了新的選擇。隨著質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和不斷完善，MALDI-TOF MS技術(shù)在真菌以及其它微生物檢測(cè)等方面的應(yīng)用將會(huì)更加廣泛。

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(本文編輯：姜敏)