田　磊，蔣寶平，樊曉峰

黑果枸杞抗衰老作用研究

田磊1，蔣寶平2，樊曉峰2*

[摘要]目的觀察黑果枸杞對D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠衰老模型的學(xué)習(xí)記憶力及抗氧化能力的影響。方法注射5% D-半乳糖制備小鼠衰老模型，灌胃給予黑果枸杞6周后，水迷宮法測定模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，試劑盒法測定腦中丙二醛(MDA)、過氧化脂質(zhì)(LPO)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力，以及血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、MDA含量及SOD活力。結(jié)果黑果枸杞能縮短衰老模型小鼠在水迷宮的逃避潛伏期、游泳總路程、近臺區(qū)停留時間、遠臺區(qū)停留時間、遠臺區(qū)游泳路程，增加衰老小鼠平均游泳速度及近臺區(qū)的游泳路程；降低模型小鼠血清中MDA含量，升高血清中GSH-Px含量和SOD活力；降低模型小鼠腦中MDA、LPO含量，升高腦中SOD活力。結(jié)論黑果枸杞能改善衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提高機體的抗氧化能力，具有一定的延緩衰老的作用。

[關(guān)鍵詞]黑果枸杞；抗衰老；抗氧化；D-半乳糖

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of Lycium ruthenicum Murr.on the learning,memory and antioxidant ability of aging mice induced by D-galactose.MethodsAging model was induced by subcutaneously injecting mice with D-galactose.At 6 weeks after administration of aqueous extract of Lycium ruthenicum Murr.,the water maze was used to determine the function of learning and memory,the analytic kit was used to measure the activity of superoxide dismutase (SOD)，the contents of malondialdehyde (MDA) and lipid peroxidation (LPO) in brain of mice,as well as the activity of SOD,the contents of MDA and glutathione peroxidase (GSH-Px) in serum of mice.ResultsLycium ruthenicum Murr.could reduce the escape latency,swimming total path,shorten the time in the near station,significantly shorten the time and swimming path in the distant station area to stay,increase the residence swimming path in the area close to the table and the average swimming speed of aging model mice in a water maze.Besides,it could reduce MDA content and increase GSH-Px content and SOD activity in serum,increase SOD activity and reduce LPO and MDA contents in brain (P<0.05,P<0.01).ConclusionLycium ruthenicum Murr.has anti-aging effect on aging model mice,and the mechanism may be related to improving learning and memory and enhancing antioxidant ability in aging mice.

Study on anti-aging effect ofLyciumruthenicumMurr.TIAN Lei1,JIANG Bao-ping2,FAN Xiao-feng2*(1.Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM,Nanjing 210029,China;2.Nanjing University of TCM,Nanjing 210023,China)

Key words：LyciumruthenicumMurr.;Anti-aging;Antioxidant;D-galactose

0引言

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.，蒙名：喬諾英-哈爾馬格、藏藥名：旁瑪)為茄科枸杞屬多年生灌木植物，是我國西北地區(qū)的一種野生植物，分布范圍較廣，其味甘、性平，果實除富含多糖、黃酮、類黃酮、微量元素等多種營養(yǎng)成分[1-2]外，還含有豐富的色素—天然原花青素。原花青素是最有效的天然水溶性自由基清除劑。已有研究表明，黑果枸杞可滋補肝腎、益精明目，適用于腰膝酸軟；同時黑果枸杞還可以降低膽固醇，興奮大腦神經(jīng)，增強免疫功能，防治癌癥，抗衰老等[3]。本文主要觀察采自青海柴達木的黑果枸杞對衰老動物學(xué)習(xí)記憶能力及抗氧化的作用，為闡明野生黑果枸杞抗衰老的作用機理及后期的藥物開發(fā)提供一定實驗依據(jù)。

1實驗材料

1.1藥品及試劑黑果枸杞果實，黑色顆粒，產(chǎn)自青海省柴達木，試驗時取25 g加100 mL礦泉水浸泡 6 h后過濾離心取上清液(紫色)用于實驗。

1.2實驗動物ICR小鼠，體重18~22 g，清潔級。揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，合格證號：SCXK(蘇)2012-0004。

1.3試劑生理鹽水：南京小營藥業(yè)集團有限公司，批號：12012121202；礦泉水：康師傅礦泉水，南京頂津食品有限公司，批號：20131207；D-半乳糖：美國Sigma公司，G0625；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化脂質(zhì)(LPO)、丙二醛(MDA)試劑盒：南京建成生物研究所提供，批號：20131122、20131121、20131126、20131122。

1.4儀器TGL-16G離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；天平：Sartorius B71250，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀：spectra Max 190，美國MD公司；Morris水迷宮及鼠通用Morris迷宮分析系統(tǒng)：淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司。

2實驗方法

2.1動物分組、造模及給藥取ICR小鼠100只，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為對照組、模型組、黑果枸杞低劑量組(簡稱“低劑量組”)、黑果枸杞中劑量組(簡稱“中劑量組”)、黑果枸杞高劑量組(簡稱“高劑量組”)。模型組及低、中、高劑量組均按500 mg/kg[4]的劑量頸背部皮下注射5% D-半乳糖，連續(xù)注射6周，以制備小鼠衰老模型，對照組頸背部皮下注射等容量的生理鹽水。造模同時，各劑量組開始灌胃給藥。低、中、高劑量組分別灌胃給予不同劑量(1.25、2.50、5.00 g/kg)黑果枸杞水提物，同樣連續(xù)灌胃6周，對照組和模型組灌胃給予等容量礦泉水。

2.2對衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響給藥6周后，用Morris水迷宮對小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力進行測定。Morris水迷宮由直徑120 cm、高 40 cm的圓柱形水池、攝像機、監(jiān)視器及圖像釆集卡等系列記錄顯示系統(tǒng)組成。其內(nèi)部被分為4個大小相等的象限，在其中的一個象限中央放置1個安全平臺，此平臺位置一旦被確定將在整個行為學(xué)測試中保持不變，平臺低于水面1 cm，水溫控制在(22±1) ℃，攝像機位于水池的正上方，便于記錄小鼠在池中的游泳軌跡，用找到平臺所需的時間(逃避潛伏期)表示小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。正式測試前，需每天訓(xùn)練2次，60 s/次，共6次，從不同點將試驗小鼠面向池壁放入水迷宮中，若小鼠 60 s 未找到平臺，將其拿到平臺上并停留20 s。正式試驗記錄小鼠在水迷宮的逃避潛伏期t、游泳總路程m、平均游泳速度v、在第一區(qū)(近臺區(qū))停留時間t和路程m、在第四區(qū)(遠臺區(qū))停留時間t和路程m，并統(tǒng)計計算結(jié)果。

2.3對衰老小鼠腦組織中LPO、MDA、SOD含量的影響游泳實驗結(jié)束后，立即將各組小鼠眼眶取血(3 000 r/min離心取血清)后處死，并在冰面上迅速取出大腦，制成 10%的腦組織勻漿，用試劑盒測定血清中的GSH-Px、SOD、MDA值，腦組織中的SOD、LPO、MDA值。

3結(jié)果

3.1對衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響見表1。

表1　對衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(n=10)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

由表1可見，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠在水迷宮的逃避潛伏期、游泳總路程、近臺區(qū)停留時間、遠臺區(qū)停留時間、遠臺區(qū)游泳路程均明顯延長，近臺區(qū)游泳路程縮短，平均游泳速度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，表明衰老模型復(fù)制成功。與模型小鼠比較，黑果枸杞低劑量衰老小鼠遠臺區(qū)游泳路程縮短(P<0.05)；中劑量組衰老小鼠在水迷宮的逃避潛伏期、游泳總路程、近臺區(qū)停留時間、遠臺區(qū)停留時間、遠臺區(qū)游泳路程縮短，近臺區(qū)游泳路程增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；高劑量組衰老小鼠在水迷宮的逃避潛伏期、游泳總路程、近臺區(qū)停留時間、遠臺區(qū)停留時間、遠臺區(qū)游泳路程縮短，平均游泳速度及近臺區(qū)的游泳路程增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

3.2對衰老小鼠腦組織中LPO、MDA含量和SOD活力的影響與正常小鼠比較，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠腦組織中SOD活力顯著下降，LPO、MDA含量顯著增加(P<0.01)。與模型小鼠比較，中、高劑量組衰老小鼠腦組織中LPO、MDA含量降低(P<0.05，P<0.01)；高劑量組衰老小鼠腦組織中SOD活力升高(P<0.01)。見表2。

表2　各組小鼠腦組織LPO、MDA含量和

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.3對衰老小鼠血清中GSH-Px、MDA含量和SOD活力的影響與正常小鼠比較，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠血清中GSH-Px含量和SOD活力顯著下降(P<0.05，P<0.01)，MDA含量顯著增加(P<0.01)。與模型小鼠比較，中、高劑量組衰老小鼠血清中MDA含量降低(P<0.05，P<0.01)，血清GSH-Px含量和SOD活力升高(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表3　各組小鼠血清GSH-Px、MDA含量和

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

4討論

衰老是生命的必經(jīng)階段，是機體的分子、細(xì)胞、器官功能發(fā)生退行性變化的生理、病理過程。自由基學(xué)說認(rèn)為，體內(nèi)自由基攻擊生命大分子，導(dǎo)致細(xì)胞和組織受損，是機體衰老的主要原因[5]。目前，實驗研究常用D-半乳糖誘發(fā)衰老模型，經(jīng)造模后的動物會出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降，自由基產(chǎn)生增加，抗氧化物酶活性降低[6]，與16~24月齡衰老鼠相似。一定時間內(nèi)連續(xù)給予D-半乳糖會使機體細(xì)胞內(nèi)的半乳糖濃度增高，生成的半乳糖醇含量也會隨之增加，導(dǎo)致機體在代謝過程中產(chǎn)生大量的自由基，進而導(dǎo)致細(xì)胞及功能障礙[6]，從而加速機體衰老過程。

自由基(也稱游離基，包括O2-、H2O2、OH-等)能引起細(xì)胞生物膜上的脂質(zhì)過氧化形成LPO。MDA是過氧化脂質(zhì)代謝的終產(chǎn)物之一[7]，是衡量機體組織自由基代謝的敏感指標(biāo)。LPO、MDA含量高低反映了機體組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度和自由基的產(chǎn)生情況。機體在產(chǎn)生自由基的同時，也產(chǎn)生抵抗自由基的抗氧化物質(zhì)，以使機體能夠清除自由基，防止自由基對組織和細(xì)胞造成損傷，即機體氧化和抗氧化系統(tǒng)。研究表明，機體氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)而導(dǎo)致的自由基過量產(chǎn)生與衰老密切相關(guān)[8-9]。SOD和GSH-Px是機體重要的自由基清除劑[10]。SOD廣泛存在于生物體的各種組織中，能促使超氧陰離子自由基變?yōu)檫^氧化氫和氧分子而被清除[11]，也能降低自由基代謝產(chǎn)物MDA的生成，使機體細(xì)胞和組織免受損害，故SOD活力的高低可反映機體清除氧自由基的能力。GSH-Px主要存在于細(xì)胞內(nèi)，能特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化氫的還原反應(yīng)，在SOD的協(xié)同作用下，將自由基H2O2還原成水，迅速清除自由基；GSH-Px還可降解氫過氧化物和減少脂質(zhì)過氧化物的生成，從而保護細(xì)胞膜免受損傷，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，有研究表明，GSH-Px隨衰老過程活性逐漸下降[12-14]。因此，機體的氧化損傷與體內(nèi)LPO、MDA及GSH-Px、SOD有很大的關(guān)聯(lián)[15-16]。

黑果枸杞可藥食兩用，果實中含有的大量糖、黃酮等物質(zhì)可對人體起到保健作用；其所含色素著色力強，且無毒性，可替代人工色素?，F(xiàn)階段對黑果枸杞藥用和經(jīng)濟價值的研究較欠缺，客觀原因是由于對其功效認(rèn)識不到位，重視程度不高，對其應(yīng)用特性研究不足。本實驗主要從抗氧化、抗衰老的角度來研究黑果枸杞，結(jié)果表明，黑果枸杞能夠?qū)笵-半乳糖引起的衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶力的衰退，降低衰老模型小鼠體內(nèi)LPO、MDA含量，升高GSH-Px含量及SOD活力。說明黑果枸杞具有一定的抗衰老作用，其作用與增強學(xué)習(xí)記憶能力、減少機體自由基的產(chǎn)生、提高機體的抗氧化能力相關(guān)，為黑果枸杞的開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化提供了一定的依據(jù)。

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