大黃滴眼液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

汪映宇

(蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，蘇州215004)

摘要：目的建立大黃滴眼液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法選用TLC法鑒別制劑中大黃有效成分大黃酸；進(jìn)行pH等項(xiàng)目的檢查；選用HPLC法測(cè)定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的含量。結(jié)果薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好。蘆薈大黃素在2.532～50.646 μg·mL`(-1)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=1.000 0)，平均回收率為91.8%，RSD為0.79%。大黃酸在3.764～75.280 μg·mL`(-1)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=1.000 0)，平均回收率為99.4%，RSD為1.46%。大黃素在2.608～52.160 μg·mL`(-1)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=1.000 0)，平均回收率為92.4%，RSD為0.87%。大黃酚在2.499～49.989 μg·mL`(-1)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)，平均回收率為92.6%，RSD為0.85%。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，可用于大黃滴眼液的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：大黃滴眼液；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜；高效液相色譜

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.007

中圖分類號(hào)：R282

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2015)03-0241-04

Abstract:ObjectiveTo establish the quality standard for Dahuang Eye Drops.Methods Thin-layer chromatography was used to identify rhein； the pH of this formulation and other items were checked； and the content of aloe-emodin， rhein，emodin and chrysophanol were determined by HPLC. Results The TLC identification was distinct and the spots were clear. The linear range of aloe-emodin was 2.532-50.646 μg·mL`(-1)(r=1.000 0) with an average recovery of 91.8% (RSD=0.79%). The linear range of rhein was 3.764-75.280 μg·mL`(-1)(r=1.000 0) with an average recovery of 99.4% (RSD=1.46%). The linear range of emodin was 2.608-52.160 μg·mL`(-1)(r=1.000 0) with an average recovery of 92.4% (RSD=0.87%). The linear range of chrysophanol was 2.499-49.989 μg·mL`(-1)(r=0.999 9) with an average recovery of 92.6% (RSD=0.85%).Conclusion This method is simple and reliable， so it could be used for the quality control of Dahuang Eye Drops.

收稿日期：(2014-10-23)

Study on the quality standard for Dahuang Eye Drops

WANG Yingyu(Suzhou Institute for Food and Drug Control， Suzhou 215004，China)

Key words: Dahuang Eye Drops； quality standard； TLC； HPLC

大黃滴眼液為蘇州市中醫(yī)醫(yī)院眼科經(jīng)驗(yàn)方，由大黃、黃芩素、硼酸、硼砂、羥苯乙酯、氯化鈉組成，臨床上用于急慢性結(jié)膜炎、紅眼及對(duì)西藥過(guò)敏的眼疾患者，療效顯著。大黃作為其主藥，對(duì)多種細(xì)菌均有不同程度的抑制作用[1]。由于傳統(tǒng)醫(yī)院制劑存在質(zhì)量不穩(wěn)定的缺點(diǎn)[2],且質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)水平普遍較低[3]，為更好地控制大黃滴眼液的質(zhì)量，本文選用TLC法鑒別制劑中的主藥大黃有效成分大黃酸[4]，選用HPLC法測(cè)定大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚的含量，以期建立可行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為保證其臨床用藥安全有效提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器拍照系統(tǒng)：CAMAG TLC VISVALIZER(瑞士卡瑪公司)；HPLC：Waters e2695/waters 2489 UV Detector(美國(guó)Waters公司)。

1.2試藥大黃滴眼液(批號(hào)140312，140324，140331)；大黃對(duì)照藥材(批號(hào)200402)、蘆薈大黃素對(duì)照品(批號(hào)201007，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)、大黃酸對(duì)照品(批號(hào)200206，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.0%)、大黃素對(duì)照品(批號(hào)200110，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.0%)、大黃酚對(duì)照品(批號(hào)201118，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；鹽酸為優(yōu)級(jí)純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸為優(yōu)級(jí)純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水；甲醇為色譜純(SIGMA-ALDRICH)；其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1性狀本品為紅棕色澄明液體。

2.2薄層色譜(TLC)鑒別取本品20 mL，加鹽酸3 mL，加熱回流30 min，冷卻，用乙醚振搖提取4次(30，20，10和10 mL)，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)舆m量甲醇溶解,并定容至5 mL量瓶中，作為供試品溶液。取陰性樣品(不加大黃)，按供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。另取大黃對(duì)照藥材0.1 g，加甲醇20 mL，浸泡1 h，濾過(guò)，取濾液5 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，冷卻，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再取大黃酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[5](《中國(guó)藥典》2010年版附錄 B)實(shí)驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶3∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干。置于紫外光燈(365 nm)下檢視。陰性色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，無(wú)斑點(diǎn)。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的5個(gè)橙黃色熒光主斑點(diǎn)，置于氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色；陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.3檢查參照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅠY要求制定本品的檢查項(xiàng)目，包括pH值、可見(jiàn)異物、滲透壓濃度、無(wú)菌、重金屬檢查、砷鹽檢查項(xiàng)。

2.4含量測(cè)定

2.4.1色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)以TURNER 100A C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為填充劑；以甲醇-1 mL·L-1磷酸溶液(75∶25)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。(流速：1 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL)。

2.4.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚對(duì)照品6.46，9.41，6.52和6.28 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，然后再稀釋10倍，至各質(zhì)量濃度為12.662，18.820，13.040和12.497 μg·mL-1，作為混合對(duì)照品溶液。

2.4.3供試品溶液的制備精密量取本品20 mL，置于燒瓶中，加鹽酸溶液3 mL，加熱回流30 min，冷卻，用乙醚分4次萃取(30，20，10和10 mL)，合并乙醚液，揮干，用甲醇定容至10 mL量瓶中，離心，即得。

2.4.4專屬性實(shí)驗(yàn)在2.4.1項(xiàng)下色譜條件，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚峰形良好，陰性樣品對(duì)主峰無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品溶液；B.大黃滴眼液陰性樣品溶液；C.大黃滴眼液樣品溶液；1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚

Fig.1 HPLC chromatograms

A.control substances；B.negative control；C.sample；1. aloeemodin；2.rhein；3.emodin；4.chrysophanol

2.4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍分別精密吸取混合對(duì)照品溶液配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。結(jié)果表明，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚對(duì)照品質(zhì)量濃度分別在2.532～50.646，3.764～75.280，2.608～52.160和2.499～49.989 μg·mL-1范圍內(nèi)，均呈良好的線性關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

Tab.1 Data of standard curves and linear ranges

成分線性范圍/μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù)r蘆薈大黃素2.532~50.646Y=56040X-337951.0000大黃酸3.764~75.280Y=46331X-393181.0000大黃素2.608~52.160Y=41602X-314051.0000大黃酚2.499~49.989Y=57953X-374230.9999

2.4.6精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按照2.4.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚的峰面積。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為0.260%，0.293%，0.378%和0.311%。

2.4.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)分別精密量取同一份大黃滴眼液樣品6份，每份20 mL，按照2.4.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述高效液相色譜條件測(cè)定。結(jié)果蘆薈大黃素含量的RSD為2.087%，大黃酸含量的RSD為1.980%，大黃素含量的RSD為1.453%，大黃酚含量的RSD為1.914%。

2.4.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取混合對(duì)照品溶液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件分析，分別在0,1，2，4，6，8和12 h進(jìn)樣10 μL，RSD分別為1.208%，0.511%，1.536%和0.668%，表明對(duì)照品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.9加樣回收率實(shí)驗(yàn)取同一批大黃滴眼液6份，精密量取10 mL，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚的質(zhì)量濃度分別為12.662，18.820，13.040和12.497 μg·mL-1)0.6 mL。照2.4.3項(xiàng)下方法制備供試溶液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.10樣品測(cè)定分取3批大黃滴眼液，按照4.3項(xiàng)下方法操作，提取供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測(cè)定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚的色譜峰面積，結(jié)果3批樣品中蘆薈大黃素的含量分別為3.328 2，3.346 6和3.397 6 μg·mL-1；大黃酸的含量分別為19.115 2，19.212 1和19.184 2 μg·mL-1；大黃素的含量分別為4.115 9，4.133 0和4.254 2 μg·mL-1；大黃酚的含量分別為3.647 8，3.674 3和3.744 6 μg·mL-1。

表2加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of recovery tests

( n=6)

3小結(jié)與討論

在供試品溶液制備中，預(yù)實(shí)驗(yàn)考察了：加鹽酸的量(1，3，5和10 mL)；酸化回流時(shí)間(30，60和90 min)；用乙醚回流和不回流萃取(乙醚回流:考察加乙醚量10，20，30和40 mL和回流時(shí)間30，60和90 min)；用乙醚萃取的量(20，20，20和10或30，20，20和10 mL)。結(jié)果表明，加鹽酸3 mL，加熱回流30 min，不用乙醚回流，直接用乙醚(30，20，20和10 mL)萃取，提取效率最高。綜上所述，本研究制備工藝合理可行，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)科學(xué)可靠。

大黃滴眼液作為蘇州市中醫(yī)醫(yī)院眼科經(jīng)驗(yàn)方，沿用至今，療效顯著，成本低，在臨床長(zhǎng)期使用中受到廣大患者的歡迎，是典型的傳統(tǒng)醫(yī)藥制劑。本文采用靈敏度高、重復(fù)性好的TLC和HPLC等方法建立和優(yōu)化了其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并做了完整的方法學(xué)驗(yàn)證，以期確保大黃滴眼液質(zhì)量的穩(wěn)定和安全，為臨床用藥安全有效提供依據(jù)。

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