造血系統(tǒng)特異性miR-155通過(guò)靶向CUX1參與小鼠巨噬細(xì)胞終末分化

何潔華廖建友吳玨鄧偉溪

【摘要】目的 篩選靶向CUX1的造血系統(tǒng)特異性miRNAs，探討其調(diào)控巨噬細(xì)胞終末分化的分子機(jī)制。方法 雙熒光報(bào)告檢測(cè)篩選靶向CUX1的造血作用相關(guān)miRNAs，Real-time PCR 檢測(cè)巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中miR-155和CUX1 mRNA表達(dá)，免疫印跡檢測(cè)CUX1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 雙熒光報(bào)告檢測(cè)篩選到5個(gè)脾臟和胸腺特異或富集miRNAs在CUX1 3’UTR上有作用位點(diǎn)，進(jìn)一步在PMA誘導(dǎo)HL-60分化為巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，miR-155隨著巨噬細(xì)胞分化表達(dá)水平逐漸上調(diào)，與之相反CUX1蛋白和mRNA表達(dá)水平逐漸下調(diào)，且miR-155能直接調(diào)控CUX1蛋白水平。結(jié)論 造血系統(tǒng)特異miR-155通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控CUX1蛋白表達(dá)參與巨噬細(xì)胞終末分化。

【關(guān)鍵詞】造血系統(tǒng)特異miR-155；CUX1；巨噬細(xì)胞；終末分化

作者單位：510120中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心

眾多研究發(fā)現(xiàn)，小鼠各個(gè)組織中存在著一批時(shí)空特異性表達(dá)miRNA［1-2］，它們的表達(dá)隨著組織發(fā)育進(jìn)程而改變，暗示它們參與組織細(xì)胞的定向分化過(guò)程［3］，然而，這些組織特異性的miRNA調(diào)控機(jī)制仍不太清楚。CUX1是普遍存在的抑制終末分化的轉(zhuǎn)錄因子，它在組織發(fā)育的后期解除對(duì)一系列組織特異性的基因的抑制作用，使組織進(jìn)入終末分化階段［4-5］。本研究篩選到造血系統(tǒng)特異miR-155調(diào)控巨噬細(xì)胞終末分化，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控CUX1發(fā)揮其功能，為證明該調(diào)控機(jī)制在小鼠組織細(xì)胞命運(yùn)決定中是普遍存在的提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

HL-60細(xì)胞使用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；11個(gè)候選miRNA mimics由銳博公司合成； RT-PCR kit購(gòu)自Takara公司；PMA購(gòu)自Sigama公司；CUX1 抗體購(gòu)買自Santa Cruz 公司，β-Actin、GAPDH、Biotin 標(biāo)記的marker 和Biotin 抗體（7727）購(gòu)買自CST公司。

1.2雙熒光報(bào)告載體構(gòu)建

從293FT細(xì)胞克隆CUX1全長(zhǎng)的3’UTR，純化后直接連入XhoI/NotI切開的psiCHECK-2 載體的海腎熒光基因的下游。

1.3雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)篩選靶向CUX1 的miRNA

使用Dual-Luciferase? Reporter kit檢測(cè)報(bào)告基因的熒光活性。數(shù)據(jù)分析時(shí)，海腎的熒光以螢火蟲的熒光作為參照，數(shù)據(jù)來(lái)自于最少三次實(shí)驗(yàn)，以（均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差）（Mean+SD）來(lái)表示。

1.4Real-time PCR

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用Trizol試劑分別提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 sec，然后于StepOne Real-Time PCR System熒光定量檢測(cè)。miRNA的表達(dá)量以U6 的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。mRNA 的表達(dá)量以GAPDH 作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量。

1.5數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

Real-time PCR 的結(jié)果數(shù)據(jù)來(lái)自于至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次三個(gè)復(fù)孔。雙熒光報(bào)告結(jié)果數(shù)據(jù)來(lái)自于三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次兩個(gè)復(fù)孔。在進(jìn)行兩組之間的差異分析時(shí)使用雙尾的Student’stest；進(jìn)行多組之間的差異分析時(shí)使用ANOVA。P<0.05 被認(rèn)為是差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1靶向CUX1的與造血作用相關(guān)miRNAs篩選

在挑選的11個(gè)脾臟和胸腺特異/富集miRNA中，5個(gè)能有效地下調(diào)熒光素酶的活力，見圖1以“*”標(biāo)出，證明它們?cè)贑UX1的3’UTR上有作用位點(diǎn)，而在多組織富集的miR-126、30a、30e均無(wú)作用位點(diǎn)，指示我們篩選到的在脾臟和胸腺特異表達(dá)或富集的靶向CUX1的5個(gè)miRNAs與造血作用顯著相關(guān)。

圖1　雙熒光報(bào)告驗(yàn)證候選的11個(gè)miRNAs靶標(biāo)CUX1 3’UTR的情況。

2.2miR-155通過(guò)靶向CUX1調(diào)控巨噬細(xì)胞分化發(fā)育的分子機(jī)制

我們挑選在雙熒光報(bào)告中作用效率最高的miR-155作進(jìn)一步研究。在HL-60體外誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞模型中，miR-155 隨著巨噬細(xì)胞的分化水平提高，表達(dá)量逐漸上調(diào)（圖2A），而CUX1蛋白逐漸下調(diào)（圖2B），且miR-155 能顯著下調(diào)CUX1蛋白（圖2C），證明miR-155能直接調(diào)控CUX1參與巨噬細(xì)胞的分化發(fā)育過(guò)程。

圖2　miR-155通過(guò)靶向CUX1調(diào)控巨噬細(xì)胞分化發(fā)育

3　討論

本研究的目標(biāo)分子CUX1 是小鼠各組織中普遍存在的重要轉(zhuǎn)錄抑制因子，它通過(guò)“cut”重復(fù)序列的DNA 結(jié)合區(qū)域結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)，從而抑制各組織中特異性基因在胚胎發(fā)育早期表達(dá)［5-6］，CUX1 作為終末分化的抑制因子，在組織細(xì)胞的分化和命運(yùn)決定中扮演著重要的角色。然而，精確調(diào)控CUX1 在不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)的調(diào)控機(jī)制仍不是很清楚。

目前，越來(lái)越多的研究證明組織特異性miRNA 在組織細(xì)胞命運(yùn)決定和組織發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，我們大膽地假設(shè)在小鼠各組織中是否存在著一批組織特異性的miRNA 通過(guò)調(diào)控CUX1 的表達(dá)參與組織細(xì)胞的命運(yùn)決定調(diào)控。我們驚喜地發(fā)現(xiàn)，在小鼠脾臟和胸腺挑選的11個(gè)組織特異性表或高表達(dá)的miRNAs中［7］，我們篩選到了5個(gè)組織特異性miRNA 能直接結(jié)合到CUX1 3’UTR 上在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控CUX1 蛋白的表達(dá)。值得注意的是，我們篩選到的能調(diào)控CUX1 的miRNA均為組織特異性表達(dá)的miRNA 而非各組織中普遍性表達(dá)的miRNA。因?yàn)槊恳粋€(gè)細(xì)胞類型和組織的發(fā)育階段都是不一致的，因此CUX1 在正確的時(shí)間被關(guān)閉是非常重要的生物過(guò)程，不能太早也不能太晚，因此組成性表達(dá)的miRNA 不能精確地調(diào)控CUX1 在發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)［8］。而組織特異性miRNA 與組成性miRNA 不同，它們的表達(dá)是受到發(fā)育過(guò)程調(diào)控的。這個(gè)作用機(jī)制很好地解釋大部分miRNA 在胚胎發(fā)育過(guò)程中以時(shí)空特異性方式表達(dá)的生物學(xué)意義。

我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)起源于內(nèi)胚層的肝臟的特異性表達(dá)miR-122通過(guò)靶向CUX1在小鼠肝細(xì)胞分化和肝臟發(fā)育中有重要的調(diào)控作用［9］，而在本研究中，我們首次證明了miR-155 對(duì)造血系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞的分化發(fā)育過(guò)程的調(diào)控作用是通過(guò)靶標(biāo)終末分化抑制因子CUX1 的表達(dá)來(lái)完成的。根據(jù)我們的研究結(jié)果可以大膽提出假設(shè)：組織特異性miRNA 靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄抑制因子CUX1 是小鼠組織細(xì)胞命運(yùn)決定和組織發(fā)育調(diào)控的通用調(diào)控機(jī)制。這是一個(gè)組織特異性miRNA 研究的重要進(jìn)展，也是miRNA 調(diào)控模式研究的一大重要發(fā)現(xiàn)。

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Hematopoietic System Specific miR-155 Regulated Macrophage Cells Terminal Differentiation by Targeting CUX1

HE JieHuaLIAO JianyouWU JueDENG WeixiSun Yat-Sen University Sun Yat-Sen Memorial Hospital，Medical Research Center，Guangzhou510120，China

【Abstract】

Objective To explore the molecular mechanism of hematopoietic system specific miRNAs which regulate macrophage cell development by targeting CUX1. Methods Screening for hematopoietic specific miRNAs targeting CUX1 with Dual-Luciferase Reporter Assay， expression of miR-155 、CD11b、CD14 and CUX1 mRNA were tested by Real-time PCR， expression of CUX1 protein was detected by Western Blot. Results We figured out five spleen and thymus specific or enrich miRNAs can target 3’UTR of CUX1 by Dual-Luciferase Reporter Assay. And in the macrophage differentiation model， we found that expression of miR-155 increased gradually， while CUX1 decreased during differentiation. Further western blot assay showed that CUX1 protein were regulated by miR-155 directly.Conclution Hematopoietic system specific miR-155 regulates macrophage terminal differentiation by repressing CUX1 at post-transcriptional level.

【Key words】Hematopoietic system specific miR-155，CUX1，Macrophage cells，Terminal differentiation

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C060604）廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014A030313175）

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2015.23.139

【中圖分類號(hào)】R446

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

【文章編號(hào)】1674-9316（2015）23-0189-02