鄭肖蘭+賀春萍+高亞男+張廣寧+習(xí)金根+鄭金龍+梁艷瓊+李銳+吳偉懷+易克賢

摘 要 根據(jù)形態(tài)及ITS序列對咖啡炭疽菌進(jìn)行了鑒定，其次通過菌絲體生長速率法測定了咖啡炭疽病菌的生物學(xué)特性及其毒力。生物學(xué)特性測定結(jié)果表明：菌絲體生長最適合的溫度為28～30℃，pH為7～8。賴氨酸和L-甘氨酸有利于菌絲體的生長，光照及碳源對菌落生長影響則不明顯。室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明：97.5%腈菌唑?qū)Х忍烤也【囊志Ч詈?，其EC50為30.79 μg/mL；其次為95%粉銹寧，其EC50為216.30 μg/mL；接著為97.2%百菌清和98%抑霉唑，其EC50分別為305.61、360.77 μg/mL。

關(guān)鍵詞 咖啡樹 ；炭疽病菌 ；生物學(xué)特性 ；毒力測定

分類號 S435.712

Biological Characteristics and Toxicity Determination of the

Colletotrichum gloeosporioides penz from Coffee arabica Linn.

ZHENG Xiaolan1） HE Chunping1） GAO Yanan2） ZHANG Guangning2） XI Jingen1）

ZHENG Jinlong1） LIANG Yanqiong1） LI Rui1） WU Weihuai2） YI Kexian1）

（1 Environment and Plant Protection Institute， CATAS， Haikou， Hainan 571101

2 College of Environment and Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228）

Abstract The Colletotrichum gloeosporioides penz from coffee was identified by conidium morphology and molecular biology. The biological characteristics and fungicides toxicity were tested by mycelium growth rate. The biological characteristic results showed that the optimal temperature for mycelium growth were between 28℃ and 30℃，the optimal pH values for mycelium growth was from pH7 to pH8，and the optimal nitrogen sources were lysine and leucine. In contrast， illumination and carbon source were insignificant for mycelium growth. The toxicity determination result showed that 97.5% myclobutanil was the greatest inhibited effect on mycelial growth， with the EC50 value of 30.79 μg/mL； following by 95% triadimefon with EC50 value 216.30 μg/mL. Then， 97.2% chlorothalonil and 98% enilconazole has better inhibition effect， the EC50 was 305.61 μg/mL and 360.77 μg/mL， respectively.

Keywords Coffee arabica Linn. ； Colletotrichum gloeosporioides ； biological characteristics ； toxicity determination

咖啡（Coffea arabica Linn.）是茜草科一種多年生常綠灌木或小喬木，全球種植面積近1 000萬hm2，是一種主要飲料作物[1-2]。 在世界三大飲料作物（咖啡、 茶葉、 可可）中，咖啡的產(chǎn)量、產(chǎn)值及消費量均居首位。目前我國主要在云南省和海南省栽培種植[3]。隨著近年咖啡種植面積的擴(kuò)大，病蟲害問題日益凸顯。咖啡常見病害炭疽病有蔓延的趨勢。該病曾在我國海南[4-5]、云南[6-7]等地相繼發(fā)生。

目前，國外對咖啡炭疽菌研究較多的主要集中在咖啡漿果炭疽病，主要涉及病原學(xué)[8-9]、抗病育種[10-13]、寄主與病原互作[14-15]等。不過，此病目前在國內(nèi)還未見有發(fā)生的報道。而在國內(nèi)則主要針對C. gloeosporioides作了些相關(guān)研究，也即僅限于云南省咖啡炭疽病的癥狀識別[6]、海南省咖啡炭疽病的發(fā)病規(guī)律[4]和農(nóng)藥篩選[5]等方面研究。我國咖啡炭疽病病斑中心呈現(xiàn)灰白色，邊緣呈黃色，至后期則完全變成灰色，并產(chǎn)生許多同心圓排列的黑色小點[16]。不過值得關(guān)注的是，在特定的條件下，如高溫或高溫多雨等條件下，炭疽菌可變得活躍，甚至可以導(dǎo)致壞死癥狀[4，17]。為此，本試驗對采自海南咖啡膠孢炭疽病菌進(jìn)行生物學(xué)特性及其毒力測定，以期為當(dāng)?shù)乜Х忍烤也〉挠行Х揽靥峁┮欢▍⒖肌?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 咖啡炭疽病菌菌株

于海南省儋州市寶島新村中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所咖啡種植基地采集典型葉片病斑，帶回實驗室采用常規(guī)組織分離、及單孢純化[18]，并經(jīng)形態(tài)鑒定以及離體葉片回接驗證，從而獲得供試菌株Cf1。供試菌株現(xiàn)保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖（Potato Dextrose Agar， PDA）培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉 20 g、蒸餾水定容至1 000 mL）；Czapek's medium（硝酸鈉2.00 g、磷酸二氫鉀1.00 g、氯化鉀0.50 g、七水硫酸鎂0.50 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30.00 g、瓊脂粉20.00 g、蒸餾水定容至1 000 mL），上述培養(yǎng)基均于121℃高壓滅菌20 min后備用。

1.1.3 試劑

碳源（半乳糖、D-果糖、D-甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、α-乳糖）、氮源（賴氨酸、L-甘氨酸、乙酸銨、L-亮氨酸、硝酸鈉、L-甲硫氨酸）均購自海南青峰生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株菌絲體收集及基因組DNA的提取

利用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基對參試菌株進(jìn)行搖菌，28℃，160 r/min 培養(yǎng)5 d后，對菌絲體進(jìn)行收集。收集的菌絲體迅速于液氮中研磨，后進(jìn)行基因組DNA提取。DNA提取采用真菌DNA提取試劑盒（E.Z.N.A Fungal DNA kit， Omega 公司，美國）提取，具體實驗步驟參考其說明書進(jìn)行。

1.2.2 rDNA-ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增

利用真菌rDNA-ITS通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，以及ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[19]，對病原菌基因組總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20 μL，其中10 μL的2×EcoTaq PCR SuperMix，上下游引物各0.5 μL（10.0 μmol/L），模板DNA 10～20 ng，最后ddH2O補(bǔ)充至20 μL。PCR擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min，15℃保存。取5 μL上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，最后在紫外燈下觀察并照相。剩余PCR產(chǎn)物用于回收后連接克隆，抽取質(zhì)粒后送往英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

1.2.3 病原菌的生物學(xué)特性研究

1.2.3.1 溫度對菌絲體生長影響的測定

將咖啡炭疽病菌參試菌株置于PDA平板培養(yǎng)基中，28℃恒溫擴(kuò)大培養(yǎng)6 d后，在培養(yǎng)基同一半徑周圍用打孔器取直徑為5 mm的菌絲塊，接種于PDA平板中央，接種后分別在10、15、20、25、28、30與37℃下恒溫培養(yǎng)。3次重復(fù)，6 d后利用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.3.2 光照對菌絲體生長影響的測定

以PDA為供試培養(yǎng)基，按1.3.1的方法接種后，分別在光暗交替（12 h光照，光照強(qiáng)度5 500 lx；12 h黑暗）、全黑暗和全光照3種光處理下28℃培養(yǎng)，設(shè)3次重復(fù)，6 d后利用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.3.3 pH值對菌絲體生長影響的測定

分別用0.1%鹽酸及0.1%氫氧化鈉將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10和11后，倒制平板、冷卻后接種。28℃培養(yǎng)，6 d后利用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.3.4 碳、氮源對菌絲體生長影響的測定

以查氏（Czapek's medium）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用相等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳（半乳糖、D-果糖、D-甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、α-乳糖），以及氮（賴氨酸、L-甘氨酸、乙酸銨、L-亮氨酸、硝酸鈉、L-甲硫氨酸）替換蔗糖和硝酸鈉制備培養(yǎng)基。接種、培養(yǎng)溫度及測量方法同步驟1.2.2.1。

1.2.3.5 殺菌劑對菌絲體生長影響的測定

通過預(yù)備試驗，篩選出各藥劑對病菌菌絲體生長具有一定抑制作用的濃度，作為各藥劑的供試濃度。按照實驗所需母液濃度，稱取原藥粉末于25 mL的容量瓶，加入溶劑 DMF 2.5 mL使原藥完全溶解，搖勻后加入2滴TX-10穩(wěn)定劑搖勻，再用無菌水定容至25 mL配制成供試藥劑母液，用系列濃度梯度稀釋法將母液制成系列濃度的含藥培養(yǎng)基（表1）。以加入等體積無菌水的PDA平板為對照。培養(yǎng)基于超凈臺凝固后，用打孔器（Φ=0.5 cm）制取已培養(yǎng)6 d的咖啡炭疽病菌菌餅，接種于含藥PDA平板中央，封口后于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待對照菌絲體直徑至少4 cm以上但不長滿皿時，用十字交叉法測量供試病菌的菌落直徑，計算生長抑制率，以及各藥劑對咖啡炭疽菌的抑制中濃度EC50與相關(guān)系數(shù)r值。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計算處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定結(jié)果

分離純化獲得的菌株經(jīng)離體接種咖啡葉片，再分離獲得的菌株鏡檢后，觀察到相同形態(tài)特征的分生孢子（圖1），并進(jìn)一步采用ITS1/ITS4對其進(jìn)行分子驗證。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得一條大小為575 bp的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小基本一致。其序列與GenBank中的序列經(jīng)BLASTn比對、同源性分析揭示，與Colletotrichum gloeosporioides非常高的同源性，達(dá)99%以上。由此，根據(jù)形態(tài)特征并結(jié)合ITS分子序列特征，將供試菌株Cf1菌株鑒定為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides Penz）。

2.2 不同溫度對供試菌株菌絲體生長的影響

測定結(jié)果表明，供試菌株在15～30℃內(nèi)菌絲體均能生長，其中在25～30℃下的菌絲體生長直徑與其余溫度差異到達(dá)極顯著，菌落直徑最大，由此表明，25～30℃為菌絲體最適合生長溫度（表2）。

2.3 光照對供試菌株菌絲體生長的影響

在光暗交替（12 h光照12 h黑暗）、全黑暗和全光照等3種光照處理下，菌絲體生長差異并不顯著，由此表明，光照對菌絲體生長影響并不明顯（表3）。

2.4 不同pH對供試菌株菌絲體生長的影響

試驗結(jié)果表明，供試菌株在不同pH培養(yǎng)基中生長存在差異，其中pH 7～8菌落直徑最大，均達(dá)到50.0 mm，最適合其菌絲體生長；而pH 3～4和pH 11時，菌絲體菌落直徑較?。ū?）。

2.5 不同氮源對供試菌株菌絲體生長的影響

試驗結(jié)果表明，供試菌株在不同氮源培養(yǎng)基上均能正常生長，菌絲體生長致密，菌落比無氮源對照茂盛。相比較而言，賴氨酸和L-甘氨酸中生長的菌落直徑與其余氮源（乙酸銨、L-亮氨酸、硝酸鈉、L-甲硫氨酸）差異極顯著，由此表明，賴氨酸和L-甘氨酸更適合其菌絲體生長（表5）。

2.6 不同碳源對供試菌株菌絲體生長的影響

供試菌株在碳源為半乳糖以及D-果糖的培養(yǎng)基上長勢與無碳對照差異不顯著，而在其余5種碳源培養(yǎng)基上長勢與無碳對照差異極顯著，菌落直徑均小于無碳對照。即供試碳源對其菌落生長無促進(jìn)作用（表6）。

2.7 不同殺菌劑對供試菌株的毒力

不同殺菌劑對供試菌株毒力測定結(jié)果表明，5種供試藥劑均有不同程度的抑制作用，其中97.5%腈菌唑的EC50值最小，為30.79 μg/mL；其次是95%粉銹寧、97.2%百菌清、98%抑霉唑，其EC50在216.30～360.77 μg/mL；然而，94%嘧菌酯的EC50為15 286.31 μg/mL，表明其對咖啡炭疽病菌幾乎無效果（表7）。

3 討論

炭疽病是咖啡的一種常見病害，幾乎所有咖啡栽培的地區(qū)都有該病發(fā)生。目前已報道，至少3種炭疽菌能對咖啡致病。根據(jù)Hindorf[20-22]等調(diào)查咖啡炭疽菌群體后發(fā)現(xiàn)，與咖啡漿果炭疽病害相關(guān)的炭疽存在3個不同炭疽菌種，其一為由Colletotrichum coffeanum引起，在人工培養(yǎng)基Malt-Extract Agar上生長為黑色，第2種則由C. acutatum引起，離體條件下菌絲體為紫色；第3種為由C. gloeosporioides，該病除侵染葉片外，還可在成熟漿果上產(chǎn)生癥狀，即所謂的晚疫病[22]。

病原菌的生物學(xué)特性是監(jiān)控病害發(fā)生的前提條件。本研究針對咖啡炭疽菌（C. gloeosporioides）的生物學(xué)特性及毒力等方面進(jìn)行了研究。生物學(xué)特性研究結(jié)果表明：適合咖啡炭疽病菌菌落生長的溫度范圍為28～30℃，在25℃以下或30℃以上該菌菌落生長較慢?？Х忍烤也【鷮λ釅A度的適應(yīng)能力較強(qiáng)，在pH 3～11的范圍內(nèi)均能生長。在中性條件下菌落的長勢最好，最適pH為7～8，在酸性和堿性條件下菌絲體長得都比較稀??；在有無光照或連續(xù)光照的條件下均可正常生長；賴氨酸和L-甘氨酸更適合其菌絲生長，碳源對菌絲生長無促進(jìn)作用。

殺菌劑敏感性試驗表明，在5種供試殺菌劑中97.5%腈菌唑的EC50值最小，僅為30.79 μg/mL，其次為95%粉銹寧、97.2%百菌清、98%抑霉唑，其EC50在216.30～360.77 μg/mL；而94%嘧菌酯的EC50為15 286.31 μg/mL，其對咖啡炭疽病菌的抑制效果最差。已有研究結(jié)果表明，1∶3∶100波爾多液、800倍滅菌威、800倍甲基托布津?qū)Х忍烤也〉奶镩g防效也很高[5]。因此，建議在病害發(fā)生期使用混劑或輪換使用以防止病害的擴(kuò)展和蔓延，既可有效降低抗藥性的產(chǎn)生，又可有效防控病害。

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