束兆林　楊紅?！￡惣t州等

摘要： 研究膠紅酵母對梨果采后貯存過程中青霉菌、灰霉菌的控制效果，采用生長速率法分別測定了膠紅酵母對這2種霉菌的室內(nèi)抑菌毒力。測定結(jié)果表明：膠紅酵母對青霉菌、灰霉菌的LD50分別為2 560萬、2 940萬CFU/mL，LD95分別為156億、251億CFU/mL。由結(jié)果看出，膠紅酵母濃度越高，抑菌效果越好。

關(guān)鍵詞： 膠紅酵母；梨果；青霉菌；灰霉菌；毒力測定

中圖分類號：S436.612.1+9 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2015）08-0110-02

水果在采摘、運銷、儲藏過程中因腐爛造成的損失是巨大的，也是全球關(guān)注的問題 [1]。梨是我國主栽水果之一，營養(yǎng)價值很高，但是由于梨果實含水量大、表皮脆弱、內(nèi)含物豐富，采摘貯存過程中主要易受青霉、灰霉等植物病原真菌的侵染 [1-2]，在貯存時容易腐爛、變質(zhì)等。因此，要大范圍流通梨果，儲運保鮮問題日益突出。長期以來，世界對水果病害包括采后病害的控制主要依賴于化學(xué)殺菌劑。隨著人們生活水平不斷提高，人們對食品安全的要求越來越強烈，因此研究并開發(fā)新的水果采后防腐途徑，采用生物防治顯得具有重要意義。梨果采收后容易受到青霉菌及灰霉菌的侵染造成爛果，許多酵母品種作為一類拮抗微生物，對果蔬采后青霉菌、灰霉菌等引起的病害都具有明顯的防治作用。從檸檬果實表面分離得到的漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），在11℃或22℃條件下，能夠抑制青霉病菌時間長達21 d [3]；假絲酵母對蘋果采后灰霉病的防治也具有很好的效果，并且發(fā)現(xiàn)Ca 2+對這種防治效果具有促進作用 [4]；用隱球酵母屬的Cryptococcus infirmo-miniatus、紅酵母屬的Rhodotorula glutinis在采收前1 d對梨進行處理，能夠有效地控制梨采后腐爛 [5]。膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）是一種拮抗酵母菌，研究表明，膠紅酵母對梨灰霉?。ㄓ葿otrytis cinerea引起）、桃果青霉病（由Penicillium expansum引起）都表現(xiàn)出顯著的拮抗效果，是被證明能有效控制水果采后病害的酵母拮抗菌 [1]。本研究通過果實室內(nèi)毒力試驗，研究膠紅酵母對青霉菌、灰霉菌的控制效果，以期為梨果采后貯存及保鮮提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 試驗材料為正常成熟的梨果實，品種為幸水，購自江蘇省句容市豐之源梨園，選擇無機械損傷、未感染、大小、成熟度等外觀品質(zhì)基本一致的果實，分組待用。

1.1.2 試驗菌株 膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa） 由江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實驗室提供；青霉菌（Penicillium italicum）、灰霉菌（Botrytis cinerea）從腐爛的梨果果實上分離得到。

1.1.3 試驗儀器 恒溫搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）；高速離心機（Thermo）；千分之一電子天平（臺灣櫻花股份有限公司）；恒溫箱（寧波江南儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種處理 在250 mL的三角瓶中裝入50 mL的 NYDB （8 g牛肉浸膏、5 g酵母浸膏、10 g葡萄糖、1 000 mL水）培養(yǎng)基，用接種環(huán)接入2環(huán)活化的膠紅酵母，37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)20 h；將上述培養(yǎng)混合物在28°C、7 000 g 條件下離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌2次，去除培養(yǎng)介質(zhì)，并用無菌生理鹽水重新懸浮酵母細胞；用血球記數(shù)板調(diào)節(jié)細胞濃度為24億 CFU/mL，再將濃度為24億CFU/mL的酵母細胞懸浮液用無菌生理鹽水依次稀釋10、100、1 000、10 000倍。將青霉菌、灰霉菌分別接種在PDA培養(yǎng)基（將200 g 去皮馬鈴薯加水煮沸20 min后過濾，濾液中加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂，用蒸餾水定容至1 000 mL）中，于28°C培養(yǎng) 7 d 后，將其懸浮在無菌水中，用血球計數(shù)板在顯微鏡下對病原菌孢子數(shù)進行測定，用無菌水調(diào)節(jié)孢子濃度至7萬個/mL。

1.2.2 室內(nèi)毒力測定 先用0.1%次氯酸鈉（NaClO）溶液將梨果浸泡30 s，用無菌水沖洗果實后，再用毛巾抹干果實，后用消過毒的打孔器在每個果實表面赤道部位制造直徑5 mm、深3 mm的傷口。每個傷口處等量加入30 μL以下濃度膠紅酵母孢子懸浮液溶液：24.0億、2.4億、2 400.0萬、240.0萬、24.0萬CFU/mL的酵母菌溶液，以及無菌水（空白對照）。3 h 后在每個傷口處接種30 μL等量的青霉菌或灰霉菌原菌孢子液，自然晾干后，將果實放入塑料筐并用保鮮膜密封，于恒溫、恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（溫度25 ℃，相對濕度95%）。每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)設(shè)10個果實。經(jīng)過5 d的培養(yǎng)，分別測量各處理病斑直徑，計算抑制率，并根據(jù)病斑直徑抑制率、濃度對數(shù)計算膠紅酵母LD50，以此評價膠紅酵母對梨果上2種常見霉菌的抑制效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理中用到的公式為：

病斑直徑抑制率=（空白對照病斑直徑-膠紅酵母處理病斑直徑）/空白對照病斑直徑×100%。

采用DPS 13.0專業(yè)版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，以病斑直徑抑制率值作為縱坐標(biāo)、藥劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)化為對數(shù)值作為橫坐標(biāo)，根據(jù)斑直徑抑制率值（y）與質(zhì)量濃度對數(shù)（x）之間的線性回歸關(guān)系，求毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)，并計算LD50、LD95及其95%置信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠紅酵母對梨果采后貯存過程中2種霉菌病斑生長的影響

從表1、表2可以看出，不同濃度的膠紅酵母對梨果上青霉菌、灰霉菌病斑生長都有一定的抑制作用。經(jīng)過5 d培養(yǎng)，對照梨果上接種青霉菌處理組的病斑沿接種中心向四周擴張，出現(xiàn)水漬狀軟腐，接種灰霉菌處理組由中心向四周出現(xiàn)淺黃褐色不規(guī)則形軟腐病病斑，2類病斑直徑分別為10.00、13.01 mm；而經(jīng)過濃度為24.0億CFU/mL膠紅酵母處理后，青霉病斑直徑僅為1.35 mm，灰霉病斑直徑為5.81 mm，病斑直徑抑制率分別達到86.5%、55.3%；膠紅酵母溶液稀釋10、100、1 000、10 000倍后對梨果上2種霉菌病斑直徑抑制率分別為72.9%、52.0%、27.3%、10.7%，69.0%、53.7%、27.5%、10.6%，均明顯優(yōu)于對照，且濃度越高，菌斑抑制效果越好。

2.2 膠紅酵母對梨果采后貯存過程中2種霉菌的毒力測定結(jié)果

由表3可知，根據(jù)病斑直徑抑制率與膠紅酵母濃度對數(shù)建立的線性關(guān)系，膠紅酵母對青霉菌、灰霉菌的LD50分別為2 560萬、2 940萬CFU/mL，LD95分別為156億、251億CFU/mL，膠紅酵母濃度對數(shù)與2種霉菌病斑抑制率之間有很強的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均達到0.99以上。

3 結(jié)論與討論

酵母菌通過以下3種途徑發(fā)揮其對病原菌拮抗作用：（1）拮抗酵母菌通過與病原菌競爭果實表面的營養(yǎng)及侵染位點，在果實表面形成保護屏障，有效抵抗病原菌的侵入 [6]；（2）拮抗酵母菌繁殖速度快，對環(huán)境適應(yīng)能力強，能有效利用果蔬表面低營養(yǎng)物質(zhì)而迅速擴大種群數(shù)量，使病原菌得不到足夠的營養(yǎng)與空間條件，不能生長增殖，達到抑制病害發(fā)生的目的；（3）酵母菌的拮抗機制還有寄生和誘導(dǎo)抗性 [7]，本試驗人為在梨果表面形成傷口，接入2種梨果貯藏期常見的病菌，結(jié)果表明，膠紅酵母對青霉菌、灰霉菌2種霉菌的抑菌LD50分別為2 560萬、2 940萬CFU/mL，LD95分別為156億、251億CFU/mL，且濃度越高，抑菌效果越好。有研究表明，23 ℃條件下黏紅酵母（Rhodotorula glutinis）濃度達到10億CFU/mL時能完全抑制柑橘上青霉病的發(fā)生 [8]，25 ℃ 條件下絲孢酵母（Trichosporon sp.）懸浮液濃度為1億CFU/mL時能顯著抑制蘋果果實表面?zhèn)谔幥嗝咕?、灰霉菌的發(fā)生 [9]。引起果實腐爛的病原微生物大多腐生性強，一般通過果實上的皮孔、氣孔或是機械損傷形成的傷口侵入，其孢子萌發(fā)和致病活動需要大量的外源營養(yǎng)。本試驗中，酵母對2種病原菌在前3 d抑制效果好，7 d后開始下降，這可能是部分病原菌突破酵母保護層，侵入果實而導(dǎo)致發(fā)病腐爛，進一步說明膠紅酵母對梨果的保護效果主要源于酵母細胞在傷口表面的快速繁殖而阻止病原菌的侵入。酵母的抑菌效果跟自身菌體數(shù)量相關(guān)，而菌體濾液不能抑制病斑的擴展，所以拮抗酵母抑菌機制不是靠產(chǎn)生抗生素，而可能是與病菌在傷口處具有較強的營養(yǎng)競爭有關(guān) [10-11]。

雖然許多酵母菌已被證實對水果病原菌具有拮抗作用，但到目前為止，我國仍未進行商業(yè)化應(yīng)用，其主要原因是在實際生產(chǎn)條件下，由于環(huán)境條件的不確定性，其防治效果往往達不到要求或者不穩(wěn)定。但由于膠紅酵母具有諸多優(yōu)點，隨著研究理論的不斷深入、生防技術(shù)的日趨完善，膠紅酵母等拮抗菌極有可能填補果蔬采后病害防治技術(shù)方面的不足，膠紅酵母在果蔬采后防腐保鮮領(lǐng)域有著廣闊的發(fā)展空間。

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