青浦區(qū)266株結(jié)核分枝桿菌基因分型及其與耐藥表型關(guān)系研究

彭榮，費(fèi)鳳英

(上海市青浦區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201700)

摘要：目的探討上海市青浦區(qū)流行的結(jié)核分枝桿菌(MTB)的主要基因型及其與耐藥表型的關(guān)系。方法分別提取266株MTB DNA，應(yīng)用多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)其進(jìn)行分型(北京基因型/非北京基因型)鑒定；采用比例法對(duì)此266株菌株進(jìn)行利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇的藥物敏感性試驗(yàn)；運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析基因分型與患者性別、年齡的關(guān)系，以及基因分型與菌株耐藥性之間的關(guān)系。結(jié)果266株菌株中北京基因型242株(90.98%)，非北京基因型24株(9.02%)。北京基因型菌株的總耐藥率為23.96%，耐多藥率為9.91%，非北京基因型的總耐藥率和耐多藥率分別為29.16%和8.33%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論北京基因型MTB可能是上海市青浦區(qū)的主要流行株，尚未發(fā)現(xiàn)北京基因型菌株和非北京基因型菌株在耐藥方面有明顯差異。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；北京基因型；耐藥

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)10-0983-04R378.91

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.004

Abstract:ObjectiveTo investigate the genotype and relationship of genotype with drug-resistant phenotypes of Mycobacterium tuberculosis(MTB)popular isolates in Qingpu, Shanghai. MethodsThe DNA of 266 MTB isolates were extracted and identified as Beijing genotype and non-Beijing genotype by multiplex polymerase chain reaction (PCR). Drug sensitivity tests of the 266 MTB isolates against streptomycin, isoniazid, rifampicin and ethambutol were performed by proportion method. The relationships of genotype with sex, age and drug-resistant phenotypes were analyzed by SPSS 17.0 statistical software, respectively. ResultsThe 242 isolates (90.98%) were identified as Beijing genotype, while 24 isolates (9.02%) were identified as non-Beijing genotype. The overall drug resistance rate of Beijing genotype isolates was 23.96%, while multidrug-resistance rate was 9.91%.The overall drug resistance rate and multidrug-resistance rate were 29.16% and 8.83% as to non-Beijing genotype. ConclusionsThe MTB popular isolates of Qingpu, Shanghai might be Beijing genotype, but it exists significant difference between Beijing and non-Beijing genotypes for drug resistance.

基金項(xiàng)目：上海市青浦區(qū)中心醫(yī)院院級(jí)課題(QY2012-12)

作者簡(jiǎn)介：彭榮，女，1986年生，碩士，技師，主要從事結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷研究。

通訊作者：費(fèi)鳳英，聯(lián)系電話：021-69719190-2509。

收稿日期：(2015-01-08)

Research on genotype and relationship of genotype with drug-resistant phenotypes from 266Mycobacteriumtuberculosisin Qingpu DistrictPENGRong,FEIFengying.(DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiQingpuDistrictCentralHospital,Shanghai201700,China)

Key words:Mycobacteriumtuberculosis; Beijing genotype; Drug resistance

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)是引起結(jié)核病的病原菌，隨著人類對(duì)基因研究的深入，人們對(duì)MTB的基因也有了新的認(rèn)識(shí)。1995年中國(guó)、蒙古首次報(bào)道了MTB北京基因型家族[1]，該家族具有相同的基因標(biāo)記，即IS6110限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性和間隔寡核苷酸分型的特征。北京基因型MTB作為世界范圍內(nèi)的第二大流行MTB，表現(xiàn)為毒力高、傳播能力強(qiáng)、易突變的特點(diǎn)，能夠逃脫卡介苗的免疫保護(hù)，并易產(chǎn)生耐藥甚至耐多藥[2]。西歐的研究結(jié)果表明，北京基因型家族株發(fā)生耐藥的危險(xiǎn)性比其它家族菌株增加約80%，并且與耐多藥MTB明顯相關(guān)[3]。同樣在國(guó)內(nèi)天津和江浙地區(qū)，北京基因型菌株在傳播中占據(jù)主導(dǎo)地位，但具體的流行特征各不相同[4-5]。本研究旨在探討上海市青浦區(qū)北京基因型及非北京基因型MTB的流行特征，分析基因型與耐藥表型、患者性別和年齡的關(guān)系，以進(jìn)一步獲得北京基因型MTB的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。

材料和方法

一、研究對(duì)象

研究所收集的266株MTB菌株來(lái)源于266例不同患者，其一般情況見表1。結(jié)合基因分型的結(jié)果可看出，北京基因型MTB感染者和非北京基因型MTB感染者在性別和年齡構(gòu)成上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　上海市青浦區(qū)2012至2013年度結(jié)核病患者基本信息　[例(%)]

二、菌株來(lái)源

上海市青浦區(qū)中心醫(yī)院是青浦區(qū)唯一的結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院，收治了青浦區(qū)大多數(shù)的肺結(jié)核病患者。收集2011年12月至2013年12月該院收治的結(jié)核病患者痰和肺泡灌洗液樣本中初次分離培養(yǎng)(排除非結(jié)核分枝桿菌以及1人多菌)的MTB臨床分離菌株266株，H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株由同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。痰和肺泡灌洗液樣本的收集、MTB的分離培養(yǎng)鑒定均參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]進(jìn)行。

三、藥物敏感性試驗(yàn)

所有菌株參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》采用比例法[7-8]進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，采用的藥物為常用的4種一線抗MTB藥物，即鏈霉素、異煙肼、利福平和乙胺丁醇(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)。

四、細(xì)菌核酸的提取

將待檢菌株轉(zhuǎn)種于中性羅氏培養(yǎng)基(上海疾控生物有限公司)，37 ℃孵育4周，待形成菌落后取1接種環(huán)菌落，使用500 L含有吐溫-80的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)(pH值7.8)充分分散，經(jīng)80 ℃水浴，2 h滅活后使用快速細(xì)菌核酸提取試劑盒(Cat:N1152，廣州東盛生物科技公司)提取核酸。

五、北京基因型和非北京基因型MTB的鑒定

1．引物設(shè)計(jì)本試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[4,9-10]采用經(jīng)改進(jìn)的多重聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)鑒定北京基因型及非北京基因型菌株。北京基因型菌株鑒定的上游引物為5′-ACAGGAAGCCGAATGAGGAC-3′，下游引物為5′-CGAAGGAGACCTCGTAGACAAG-3′(GenBank AF390039)；非北京基因型菌株鑒定的上游引物為5′-TGGGTCTGACGACTTGAACAC-3′，下游引物為5′-ACCTTCAGCACCACCATCATC-3′(GenBank BX842581)。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為261和491 bp。

2．PCR體系的建立采用15 μL體系，引物終濃度為0.2 μmol/L，DNA模板為10～20 ng，2×Master Mix 7.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

3．多重PCR的建立提取H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株、已確定的北京基因型MTB和臨床分離株基因組作為模板，同時(shí)用北京基因型及非北京基因型菌株混合引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。為防止交叉污染，每次試驗(yàn)均設(shè)置無(wú)模板對(duì)照。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、多重PCR鑒定

266株菌株中北京基因型MTB 242株(90.98%)，非北京基因型MTB 24株(9.02%)。見圖1。

二、藥物敏感性試驗(yàn)

242株北京基因型MTB中184株全敏感，58株耐藥，其中耐多藥菌株24株，耐鏈霉素菌株41株(包括耐多藥菌株)，耐異煙肼菌株14株(包括耐多藥菌株)，耐利福平菌株23株(包括耐多藥菌株)，耐乙胺丁醇菌株14株(包括耐多藥菌株)；24株非北京基因型MTB中17株全敏感，7株耐藥，其中耐多藥菌株2株。北京基因型菌株與非北京基因型菌株的分型在耐藥表型方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.892，P>0.05)。見表2。

注：M為DNA marker；1為H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株(非北京基因型菌株)擴(kuò)增條帶(491 bp)；2為已知北京基因型菌株擴(kuò)增條帶(約261 bp)； 3～24為臨床分離株擴(kuò)增條帶(3、6、9、12、13、14和18為非北京基因型菌株；4、5、7、8、10、11、15～17和19～24為北京基因型菌株) 圖1　多重PCR鑒定北京基因型MTB的瓊脂糖電泳圖

表2　上海市青浦區(qū)2012至2013年度北京基因型和非北京基因MTB的耐藥情況　[例(%)]

討論

中國(guó)范圍內(nèi)北京基因型MTB流行至少半個(gè)世紀(jì)[11]，但我們對(duì)北京基因型MTB的認(rèn)識(shí)也僅十幾年。在中國(guó)和周邊的一些國(guó)家及地區(qū)，北京基因型菌株均占有較高的比例[12-14],甚至在遙遠(yuǎn)的南美，也有北京基因型菌株的報(bào)道[15]。在最新的意大利米蘭的研究發(fā)現(xiàn)，北京基因型菌株所占的比例從1996年的1.7%上升到2009年的5.4%，并且大部分來(lái)源于擁有中國(guó)或前蘇聯(lián)國(guó)家血統(tǒng)的人，同時(shí)耐多藥與北京基因型明顯相關(guān)[16]。因此，北京基因型MTB何時(shí)出現(xiàn)并傳播，怎樣傳播，與東南亞和前蘇聯(lián)人群有著怎樣的關(guān)系；北京基因型MTB各亞型與耐藥性有何關(guān)系，其耐藥機(jī)制及其流行病學(xué)特點(diǎn)等許多問(wèn)題尚需進(jìn)一步闡明，以便為結(jié)核病的防治提供理論依據(jù)。

隨著分子流行病學(xué)研究的深入，越來(lái)越多的方法被運(yùn)用于MTB的基因分型，如間隔寡核甘酸分型方法、多重PCR以及數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列方法(variable number of tandem repeat，VNTR)[17]。本研究根據(jù)北京基因型菌株基因組中Rv2816和Rv2819序列缺失的特點(diǎn)，采用改進(jìn)的多重PCR，使用普通PCR儀一步法鑒定北京基因型和非北京基因型MTB。此方法簡(jiǎn)單、易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，在普通臨床實(shí)驗(yàn)室即可開展，且有文獻(xiàn)報(bào)道該方法與間隔寡核甘酸分型方法的結(jié)果一致率為100%[9]。

本研究是基于2012至2013年間，上海市青浦區(qū)中心醫(yī)院收取的266株MTB，結(jié)果表明北京基因型MTB在該地區(qū)占主導(dǎo)地位，這與國(guó)內(nèi)的研究[5-6]基本一致，但北京基因型與非北京基因型菌株的分型與耐藥表型間尚無(wú)明顯相關(guān)性，且未發(fā)現(xiàn)北京基因型和非北京基因型菌株之間在年齡、性別方面有明顯差異，這與香港的研究相一致[18]。北京基因型與抗結(jié)核藥物的耐藥以及患者年齡無(wú)明顯相關(guān)，而鄰近的江浙地區(qū)研究表明感染北京基因型菌株的結(jié)核病患者發(fā)生耐異煙肼、耐利福平和耐多藥結(jié)核病的危險(xiǎn)性較大[6]。不同區(qū)域的研究結(jié)果不盡相同，可能是由于北京基因型菌株本身也有許多亞型，不同人群中北京基因型MTB亞型分布不同，其與耐藥的關(guān)系也不同[19]。在越南的最新研究發(fā)現(xiàn)，北京基因型又分為典型和非典型2種亞型，典型菌株更容易發(fā)生異煙肼和鏈霉素的耐藥[20]。因此，不同國(guó)家和地區(qū)人群中，耐藥或耐多藥結(jié)核病是否與北京基因型菌株所占的比例有關(guān)，以及是否與北京基因型亞型在這些人群中的分布情況有關(guān)，尚需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

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(本文編輯：姜敏)