翟淑紅　雷霄宇　陳濤

摘要：分析了Folin-Ciocalteu法測定山西老陳醋中總多酚含量、Al（NO3）3-NaNO2-NaOH體系比色法測定山西老陳醋中總黃酮含量的條件。通過單因素試驗(yàn)得到了總多酚和總黃酮的優(yōu)化試驗(yàn)條件，并根據(jù)穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度、加標(biāo)回收率試驗(yàn)對方法進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果表明2種測定方法簡便、快速、準(zhǔn)確、可靠，可用于山西老陳醋及其他食醋產(chǎn)品中多酚和黃酮的測定。

關(guān)鍵詞：山西老陳醋；總多酚；總黃酮；檢測

中圖分類號(hào)：TS264.22 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）24-6372-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.072

Abstract：The suitable conditions of determination of the content of total polyphenols in Shanxi aged vinegar using Folin-Ciocalteu method， the content of total flavonoids in the Shanxi aged vinegar using Al（NO3）3-NaNO2-NaOH colorimetric method were studied. The optimum experimental conditions were obtained by single factor experiment. The stability， reproducibility， precision， recovery rate test were employed to evaluate the experimental method. The results showed that two kinds of method were simple， rapid， accurate and reliable， which could be used for determination of polyphenols and flavonoids Shanxi aged vinegar and other vinegar products.

Key words：Shanxi aged vinegar；total polyphenol；flavonoids；determination

食醋是人們生活中不可缺少的日常用品，也是一種國際性的重要調(diào)味品。食醋對心腦血管疾病、腫瘤等有一定的預(yù)防和治療作用，這與食醋中酚類物質(zhì)的抗氧化性高度相關(guān)[1]。徐清萍等[2]對國內(nèi)26種食醋產(chǎn)品進(jìn)行了抗氧化活性研究，結(jié)果表明，這些食醋產(chǎn)品都具有一定的抗氧化性，抗氧化性的強(qiáng)弱主要差異在于醋中含有的多酚類物質(zhì)含量的不同。

山西老陳醋是中國四大名醋之一，它的生產(chǎn)至今已有3 000余年的歷史，其特殊的工藝特點(diǎn)使山西老陳醋以色、香、醇、濃、酸五大特征著稱于世。雖然近年來國內(nèi)對食醋多酚的報(bào)道日漸增多[3-6]，但關(guān)于山西老陳醋總多酚類和總黃酮物質(zhì)的研究報(bào)道還甚少。該文采用分光光度法測定了山西老陳醋樣品的總多酚和總黃酮含量，探討了山西老陳醋樣品的合適的測定條件，旨在確保山西老陳醋中抗氧化活性測定方法的準(zhǔn)確性和可靠性，同時(shí)也為闡明山西老陳醋的保健機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為開發(fā)具備營養(yǎng)、保健和食療作用的功能產(chǎn)品提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品為山西老陳醋集團(tuán)提供的東湖牌三年老陳醋。

鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、鹽酸等均為國產(chǎn)分析純。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購于美國Sigma公司。Folin-Ciocalteu試劑是實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 主要儀器

Spectrum lab 22型紫外-可見分光光度計(jì)；AL204電子分析天平；電熱恒溫培養(yǎng)箱；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.3 方法

1.3.1 Folin-Ciocalteu法測定山西老陳醋總酚 樣品稀釋100倍作為待測樣品溶液。取1 mL待測樣品，加入一定體積的1 mol/L FC試劑，再加入5 mL一定濃度的碳酸鈉溶液，用去離子水定容至25 mL，混勻，在一定溫度下靜置避光反應(yīng)一定時(shí)間，冷卻至室溫，以試劑空白為參比，在765 nm下測定吸光度，分析FC試劑的體積、碳酸鈉溶液濃度及反應(yīng)溫度和時(shí)間對吸光度的影響，從而選擇出Folin-Ciocalteu法測定山西老陳醋總酚含量的最佳條件，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 Al（NO3）3-NaNO2-NaOH體系比色法測定山西老陳醋總黃酮 取2.5 mL待測樣品溶液，加入一定體積的5%亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min，加入相同體積的10%（m/V）硝酸鋁溶液，混勻，靜置，再加入一定體積的4%（m/V）氫氧化鈉溶液，定容至25 mL，充分混勻，靜置一定時(shí)間，在510 nm下測定吸光度。研究亞硝酸鈉溶液體積、氫氧化鈉溶液體積及反應(yīng)時(shí)間對吸光度的影響，找到Al（NO3）3-NaNO2-NaOH體系比色法測定山西老陳醋總黃酮含量的最佳條件，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 Folin-Ciocalteu法測定總多酚含量

單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，F(xiàn)C溶液體積、碳酸鈉濃度、測定溫度及時(shí)間對吸光度的影響分別如圖1至圖3所示。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，F(xiàn)olin-Ciocalteu法測定山西老陳醋總酚含量的最佳條件是：吸取1 mL稀釋100倍的待測樣品溶液，加入3.5 mL 1 mol/L FC試劑，再加入5 mL質(zhì)量濃度為12.5%的碳酸鈉溶液，用去離子水定容到25 mL，混勻，在30 ℃下避光反應(yīng)90 min，冷卻到室溫，測定OD765 nm。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)（x），OD765 nm為縱坐標(biāo)（y），繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：y=0.216 3x+0.016 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0，總酚濃度在0～3.6 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2 Folin-Ciocalteu比色法的評價(jià)

取樣品反應(yīng)完全后放置一定時(shí)間，測定多酚含量。結(jié)果表明，該方法在體系反應(yīng)完全后放置120 min內(nèi)測定值的RSD為0.716，表明該方法較為穩(wěn)定。

取同一樣品5份，分別測定樣品中總多酚的含量，其RSD為1.07%。結(jié)果表明，該方法重現(xiàn)性較好。

對同一份樣品進(jìn)行重復(fù)5次測定，其RSD為1.08%。結(jié)果表明，該方法精密度較好。

依次編號(hào)新醋、1年陳釀醋、2年醋、3年醋、5年醋、8年醋為“1-6”號(hào)。山西老陳醋樣品Folin-Ciocalteu比色法加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，1-6號(hào)老陳醋樣品用該方法測定總多酚的回收率為97.22%～1033.7%。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確可靠，適用于山西老陳醋總多酚含量的測定。

2.3 Al（NO3）3-NaNO2-NaOH體系比色法測定總黃酮含量

單因素試驗(yàn)的設(shè)計(jì)如表3所示。亞硝酸鈉體積、氫氧化鈉體積、反應(yīng)時(shí)間對吸光度的影響分別如圖5至圖7所示。

根據(jù)單因素試驗(yàn)測定結(jié)果，Al（NO3）3-NaNO2-NaOH體系比色法測定山西老陳醋總黃酮含量的最佳條件是：10倍稀釋的山西老陳醋樣品2.5 mL加入1.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液（試劑現(xiàn)配現(xiàn)用），混勻，靜置6 min，加入1.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液，混勻，靜置6 min，再加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氫氧化鈉溶液，定容至25 mL，充分混勻，靜置20 min，以同濃度樣品為空白，在510 nm波長下比色。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD510 nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程和相關(guān)系數(shù)分別為：y=0.012 5x+0.000 8，R2=0.999 9。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0～65 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.4 Folin-Ciocalteu比色法的評價(jià)

取樣品反應(yīng)完全后放置一定時(shí)間，測定總黃酮含量。其RSD為0.874%。結(jié)果表明，該方法在體系反應(yīng)完全后30 min內(nèi)仍較穩(wěn)定。

取同一樣品5份，分別測定樣品中總黃酮的含量。其RSD為1.101%。結(jié)果表明，該方法重現(xiàn)性較好。

對同一份樣品重復(fù)5次測定，其RSD為1.158%。結(jié)果表明，該方法精密度較好。

依次為新醋、1年陳釀醋、2年醋、3年醋、5年醋、8年醋進(jìn)行編號(hào)，編號(hào)為1-6。山西老陳醋樣品中總黃酮加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表4。1-6號(hào)樣品的回收率為92.58%～108.51%。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確可靠，可用于山西老陳醋總黃酮含量的測定。

2.5 山西老陳醋樣品總酚和總黃酮含量的測定

根據(jù)最佳條件的測定方法測定5年陳年老陳醋中總多酚含量為7.263 1 mg/mL，總黃酮含量為3.033 7 mg/mL，高于參考文獻(xiàn)中山西老陳醋中總多酚和總黃酮含量[7，8]。這和穩(wěn)定的測定方法有一定關(guān)系，也與山西老陳醋獨(dú)特的釀造工藝——熏醅和夏伏曬、冬撈冰、陳釀老熟的工藝等有密切聯(lián)系，在熏醅和陳釀過程中醋液發(fā)生美拉德反應(yīng)可能產(chǎn)生了總多酚和總黃酮物質(zhì)[9，10]。這就意味著可以通過監(jiān)控生產(chǎn)過程中總酚、總黃酮含量變化來辨別食醋質(zhì)量優(yōu)劣，并為功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供指導(dǎo)。

3 小結(jié)

采用Folin-Ciocalteu法測定山西老陳醋中總酚含量。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度在0～3.6 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。該反應(yīng)體系在完全反應(yīng)后放置120 min內(nèi)測定值仍保持穩(wěn)定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%，加標(biāo)回收率為97.22%～103.37%。因此，利用此方法對山西老陳醋中總多酚含量進(jìn)行測定，方法簡便、快速、準(zhǔn)確，對山西老陳醋品質(zhì)鑒別起著重要的指導(dǎo)作用。

采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH體系比色法測定山西老陳醋中總黃酮含量。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0～65 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。該體系反應(yīng)完全后放置30 min內(nèi)測定值仍比較穩(wěn)定，重現(xiàn)性精密度好，加標(biāo)回收率在92.58%～108.51%之間。因此，利用優(yōu)化后的測定條件對山西老陳醋中總黃酮含量進(jìn)行測定，方法可靠，為鑒別山西老陳醋的真?zhèn)魏拖乱徊皆囼?yàn)奠定了基礎(chǔ)。

總酚和總黃酮是山西老陳醋的主要功能成分，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，下一步可以研究山西老陳醋消除DPPH自由基、消除亞硝酸鹽能力等來表征山西老陳醋的抗氧化功能。

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