·論著·

阻斷鈣激活鉀通道對宮頸癌細(xì)胞增殖及鉀通道電流的影響

劉玲，聶丹，范凌曄，詹平，錢燕萍，毛熙光

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

摘要：目的觀察鈣激活性中電導(dǎo)鉀離子通道(IKCa1)被阻斷后對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖及IKCa1膜電位的影響。方法分別用IKCa1阻斷劑克霉唑和RNA干擾法阻斷HeLa細(xì)胞的IKCa1后，用RT-PCR技術(shù)檢測HeLa細(xì)胞的IKCal mRNA，MTT法檢測細(xì)胞OD值，膜片鉗技術(shù)檢測細(xì)胞IKCa1電流。結(jié)果克霉唑阻斷IKCa1后，HeLa細(xì)胞的IKCa1 mRNA表達(dá)降低、IKCa1電流減弱、細(xì)胞OD值下降，與對照組相比，P均<0.05。RNA干擾法阻斷IKCa1后，Hela細(xì)胞的IKCa1 mRNA表達(dá)下降、IKCa1電流減弱、細(xì)胞OD值降低，與空白對照組和陰性轉(zhuǎn)染組相比，P均<0.05。結(jié)論 阻斷IKCa1能有效抑制HeLa細(xì)胞增殖，下調(diào)細(xì)胞IKCa1 mRNA的表達(dá)，降低其IKCa1電流；IKCa1通過調(diào)控HeLa細(xì)胞膜電位而影響其信號(hào)傳遞，調(diào)控HeLa細(xì)胞的增殖。

關(guān)鍵詞：離子通道；鉀離子通道；鈣激活性中電導(dǎo)鉀離子通道；鉀離子通道阻斷劑；克霉唑；小分子干擾RNA技術(shù)；宮頸癌細(xì)胞；HeLa細(xì)胞株

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.001

中圖分類號(hào)：R737.33文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金資助項(xiàng)目(2008JY0014-1)；四川省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目(110373)；四川省瀘州市科技局科研項(xiàng)目(2013LZLY-J30)。

作者簡介：第一劉玲(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)閶D科腫瘤、生殖內(nèi)分泌。E-mail: eye99@163.com

作者簡介：通信毛熙光(1965-)，男，碩士，教授，主要研究方向?yàn)閶D科腫瘤。E-mail: mxg6639@163.com

收稿日期：(2015-07-07)

Effects of blocking intermediate-conductance-Ca2+-activated K+channels

on proliferation of cervical cancer cells and potassium channel current

LIULing,NIEDan,FANLing-ye,ZHANPing,QIANYan-ping,WANGChun-yan,MAOXi-guang

(TheAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzou646000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of blocking intermediate-conductance-Ca2+-activated K+ channels (IKCa1) on the cell proliferation and the membrane potential changes of IKCa1 in cervical cancer HeLa cells. MethodsIKCal of HeLa cells was blocked with IKCa1 channel inhibitor (clotrimazole, CLT) and RNA interference, respectively. RT-PCR was used to detect the expression of IKCal mRNA in HeLa cells. The OD value of cells was detected by MTT, and IKCal current was detected by the patch clamp technique in HeLa cells. ResultsWhen IKCal was blocked with CLT in HeLa cells, the expression of IKCal mRNA was decreased, IKCal current wakened and the OD value of cells decreased as compared with that of the control group (all P<0.05). When IKCal was blocked by small interfering RNA technology in HeLa cells, the expression of IKCal mRNA reduced, IKCal current wakened, and the OD value of cells decreased as compared with that of the blank group and negative transfection group (all P<0.05). ConclusionsBlocking IKCa1 could inhibit cell proliferation, down-regualte the expression of IKCa1 mRNA and cut down the IKCal current in HeLa cells. IKCa1 could regulate the cell proliferation of HeLa cells by directly regulating the membrane potential and thus affecting its signal transmission.

Key words: ion channel; potassium channel; intermediate-conductance-Ca2+-activated K+channels; potassium channel blocker; clotrimazole; small interfering RNA technology; cervical carcinoma cells; HeLa cell line

目前，宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確。離子通道是一種成孔蛋白，它通過允許某種特定類型的離子依靠電化學(xué)梯度穿過該通道，幫助細(xì)胞建立和控制質(zhì)膜間的微弱電壓差，以維持細(xì)胞調(diào)控信息的正常表達(dá)和傳遞，這些離子通道存在于所有細(xì)胞的細(xì)胞膜上[1～3]。離子通道包括鉀離子通道家族、氯離子通道家族、鈣離子通道家族、質(zhì)子通道家族等。其中鉀離子通道的功能異常在腫瘤細(xì)胞的生長繁殖過程中發(fā)揮了重要作用。在人類子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中均發(fā)現(xiàn)有鈣激活性中電導(dǎo)鉀離子通道(IKCa1)蛋白的高表達(dá)[4，5]。我們的前期研究[6]也發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織和細(xì)胞中IKCa1蛋白呈高表達(dá)。2012年2月，我們采用小分子干擾RNA(shRNA)技術(shù)和鉀離子通道阻斷劑克霉唑阻斷IKCa1后觀察了宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖情況及其IKCa1膜電位的變化?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1主要材料宮頸癌細(xì)胞株HeLa由重慶醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。pGenesil-1.1質(zhì)粒、大腸桿菌菌株DH5α購自武漢晶賽生物技術(shù)工程有限公司；質(zhì)粒pGenesil-IK1、質(zhì)粒pGenesil-IK2、質(zhì)粒pGenesil-HK由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2HeLa細(xì)胞IKCa1的阻斷、IKCa1 mRNA檢測、增殖情況觀察、IKCa1電流檢測方法

1.2.1HeLa細(xì)胞IKCa1的克霉唑阻斷、IKCa1 mRNA檢測、增殖情況觀察、IKCa1電流檢測方法將鉀離子通道阻斷劑克霉唑干粉用無水乙醇和含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配制，終濃度分別為5、10、20、40 μmol/L。將HeLa細(xì)胞調(diào)整密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液。取100 μL細(xì)胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，分別加入5、10、20、40 μmol/L的克霉唑制劑180 μL(分別為實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組)；另取同樣密度的HeLa細(xì)胞懸液加入含等量無水乙醇的無克霉唑培養(yǎng)液180 μL(對照組)；每組6孔，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，用RT-PCR法檢測細(xì)胞的IKCa1 mRNA：TRIzol提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參照擴(kuò)增IKCa1。IKCa1擴(kuò)增引物:上游 5′-GTGCGTGCAGGATTTAGGG-3′，下游5′-TGCTAAGCAGCTCAGTCAGGG-3′，擴(kuò)增片段為856 bp；GAPDH擴(kuò)增引物:上游5′-ATGCTGGCGCTGAGTACGTC-3′，下游5′-GGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3′，擴(kuò)增片段為263 bp。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min,加Tat/酶，94 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次，終延伸72 ℃ 10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，分析并檢測各電泳條帶的積分光密度，結(jié)果以IKCa1 mRNA與GAPDH mRNA的積分光密度比值表示。在上述相同時(shí)間點(diǎn)、用MTT法檢測細(xì)胞OD值。

取HeLa細(xì)胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，接種于培養(yǎng)瓶，用RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后分組(對照組、實(shí)驗(yàn)組)并分別加入無克霉唑培養(yǎng)液、含克霉唑培養(yǎng)液(克霉唑濃度為20 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PBS沖洗。收集細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，用膜片鉗技術(shù)檢測其IKCa1電流：將膜片鉗的電極輕壓到細(xì)胞表面進(jìn)行負(fù)壓抽吸，使之形成1～4 GΩ高阻封接，破膜后補(bǔ)償串聯(lián)電阻及抵消電容電流，形成全細(xì)胞記錄形式。信號(hào)經(jīng)膜片鉗放大器( EPC29，HEKA)放大,用Axon “pCLAMP”(美國)采集、分析數(shù)據(jù)。

1.2.2HeLa細(xì)胞IKCa1的shRNA技術(shù)阻斷、IKCa1 mRNA檢測、增殖情況觀察、IKCa1電流檢測方法選取我們前期成功構(gòu)建的pGenesil-1.1- IKCa1 shRNA(干擾序列)、pGenesil-1.1-HK(陰性對照序列)重組質(zhì)粒載體，用LipofectamineTM2000脂質(zhì)分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，并將細(xì)胞分為pGenesil-IKCa1 shRNA組(轉(zhuǎn)染組)、pGenesil-HK組(陰性對照組)，另設(shè)HeLa細(xì)胞對照組(空白對照組)，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，用RT-PCR法檢測HeLa細(xì)胞的IKCa1 mRNA(方法同上),MTT法檢測細(xì)胞OD值。取培養(yǎng)48 h時(shí)的細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白以判斷轉(zhuǎn)染情況并篩選出轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，用膜片鉗技術(shù)檢測其IKCa1電流：取各組轉(zhuǎn)染陽性HeLa細(xì)胞，接種于多聚賴氨酸載玻片上，37 ℃孵育1 h，選擇形態(tài)正常、大小中等的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)樣本，IKCa1電流檢測方法同上。

2結(jié)果

2.1克霉唑阻斷IKCa1的HeLa細(xì)胞IKCa1 mRNA表達(dá)、增殖情況、IKCa1電流變化

2.1．1克霉唑阻斷IKCa1的HeLa細(xì)胞IKCa1 mRNA表達(dá)變化不同時(shí)間點(diǎn)各組HeLa細(xì)胞IKCa1 mRNA的表達(dá)見表1。由表1可見，隨克霉唑濃度增加和作用時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組HeLa細(xì)胞IKCa1 mRNA的表達(dá)水平明顯下降；各時(shí)間點(diǎn)組間相比，P均<0.05；實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組與對照組相比，P均<0.05。

2.1.2克霉唑阻斷IKCa1的HeLa細(xì)胞OD值變化不同時(shí)間點(diǎn)各組HeLa細(xì)胞OD值見表2。由表2可見，實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組HeLa細(xì)胞OD值逐漸降低；各時(shí)間點(diǎn)組間相比，P均<0.05；實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組與對照組相比，P均<0.05。

表1　 不同時(shí)間點(diǎn)各組HeLa細(xì)胞IKCa1 mRNA的

表2　不同時(shí)間點(diǎn)各組HeLa細(xì)胞OD值

2.1.3克霉唑阻斷IKCa1的HeLa細(xì)胞IKCa1電流變化在鉗制膜電位為+60 mV時(shí)，對照組及實(shí)驗(yàn)組IKCa1電流分別為(23.07±5.47)、(9.84±4.46)pA/pF，兩組相比，P>0.05。

2.2shRNA技術(shù)阻斷IKCa1的HeLa細(xì)胞IKCa1 mRNA表達(dá)、增殖情況、IKCa1電流變化

2.2.1shRNA技術(shù)阻斷IKCa1的HeLa細(xì)胞IKCa1 mRNA的表達(dá)變化不同時(shí)間點(diǎn)各組HeLa細(xì)胞IKCa1 mRNA的表達(dá)見表3。由表3可見，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，轉(zhuǎn)染組HeLa細(xì)胞IKCa1 mRNA的表達(dá)水平逐漸下降；各時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染組IKCa1 mRNA與陰性對照組和空白對照組相比，P均<0.05；陰性對照組與空白對照組相比，P均>0.05。

表3　 不同時(shí)間點(diǎn)各組HeLa細(xì)胞IKCa1 mRNA的

2.2.2shRNA技術(shù)阻斷IKCa1的HeLa細(xì)胞OD值變化不同時(shí)間點(diǎn)各組HeLa細(xì)胞OD值見表4。由表4可見，各時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染組HeLa細(xì)胞OD值降低，與陰性對照組和空白對照組相比，P均<0.05；陰性對照組和空白對照組各時(shí)間點(diǎn)的OD值相比，P均>0.05。

表4　不同時(shí)間點(diǎn)各組HeLa細(xì)胞OD值

2.2.3shRNA技術(shù)阻斷IKCa1的HeLa細(xì)胞IKCa1電流變化在鉗制膜電位為+60 mV時(shí)，空白對照組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染組IKCa1電流分別為(21.25±4.67)、(21.3±5.51)、(10.93±4.4)pA/pF，轉(zhuǎn)染組與空白對照組和陰性地照組相比，P均<0.05；空白對照組和陰性地照組相比，P>0.05。

3討論

IKCa1作為鉀離子通道家族中的一個(gè)重要組成部分，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜電位，參與了細(xì)胞的多種生物學(xué)活動(dòng)，如細(xì)胞因子的分泌、電解質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、滲透壓的維持、細(xì)胞遷移及增殖等生理活動(dòng)[7～9]。IKCa1的基因活化、增強(qiáng)表達(dá)、通道開放和電壓強(qiáng)度變化、通道密度參數(shù)等都影響腫瘤細(xì)胞的增殖，這表明IKCa1與惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[10,11]。Susumu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，人前列腺增生組織中IKCa1蛋白高表達(dá)，IKCa1抑制劑可抑制前列腺組織的增生。Joanne等[13]研究發(fā)現(xiàn)，IKCa1調(diào)控人胚胎腎HEK293細(xì)胞的增殖，阻斷IKCa1通道能抑制HEK293細(xì)胞增殖，而IKCa1表達(dá)的細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，IKCa1對HEK293細(xì)胞增殖的調(diào)控可能是通過ERK1/2和JNK信號(hào)途徑共同作用完成的。

克霉唑作為已知的IKCa1阻斷劑已被廣泛應(yīng)用[14]。本研究用克霉唑干預(yù)HeLa細(xì)胞后，細(xì)胞IKCa1 mRNA的表達(dá)水平下降、IKCa1電流減弱，表明克霉唑能有效阻斷HeLa細(xì)胞IKCa1通道。此外，本研究將IKCa1干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，細(xì)胞IKCa1 mRNA的表達(dá)水平下降、電流減弱，表明IKCa1基因下調(diào)能有效阻斷HeLa細(xì)胞IKCa1通道。本研究用克霉唑及shRNA技術(shù)阻斷IKCa1后，隨克霉唑濃度升高和作用時(shí)間延長，對HeLa細(xì)胞生長的抑制作用也增強(qiáng)。可見阻斷IKCa1，細(xì)胞增殖受到明顯影響。張英麗等[15]研究發(fā)現(xiàn)，KCa3.1的相對特異性阻斷劑TRAM-34明顯影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC1-A 和Ishikawa的增殖，且呈劑量及時(shí)間依賴性；應(yīng)用RNA干擾技術(shù)可抑制HEC-1-A和Ishikawa細(xì)胞株中KCa3.1的蛋白表達(dá)并抑制細(xì)胞的增殖。Haren等[16]通過免疫組化、PCR等生物學(xué)手段和膜片鉗技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，IKCa1在乳癌組織和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)升高，IKCa1 mRNA和蛋白表達(dá)水平也升高,并且升高幅度與腫瘤的期別、分化程度及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)[6],宮頸癌組織中IKCa1 mRNA表達(dá)明顯高于正常宮頸組織，本研究發(fā)現(xiàn)IKCa1基因被阻斷和沉默后HeLa細(xì)胞IKCa1 mRNA的表達(dá)也明顯降低、IKCa1電流減弱，可能是IKCa1通道被阻斷以及IKCa1基因被沉默后，細(xì)胞的電位和能量轉(zhuǎn)運(yùn)受到影響，細(xì)胞的滲透壓發(fā)生改變，細(xì)胞失水，其物質(zhì)代謝和生長代謝受到影響，使細(xì)胞不能獲得足夠的營養(yǎng)，繼而出現(xiàn)功能紊亂而發(fā)生壞死、崩解，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。這與De Marchi等[17]研究發(fā)現(xiàn)的IKCa1對細(xì)胞線粒體的影響一致。

綜上所述，阻斷IKCa1能下調(diào)Hela細(xì)胞IKCa1 mRNA的表達(dá)，有效抑制HeLa細(xì)胞增殖，降低其IKCa1電流。IKCa1通過調(diào)控HeLa細(xì)胞膜電位而影響其信號(hào)傳遞，調(diào)控HeLa細(xì)胞的增殖。在深入探討IKCa1的作用機(jī)制及其對細(xì)胞生長調(diào)控的基礎(chǔ)上，研究開發(fā)具有對宮頸癌特異性的抑制IKCa1活性或表達(dá)的藥物，將有助于宮頸癌的治療。

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