作者單位：1.100039北京，武警總醫(yī)院消化科；2.100850北京，解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所

細(xì)菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠抑郁行為的影響

王寰1,徐陽(yáng)1,屈亞威1,張成崗2,劉海峰1

【摘要】目的研究細(xì)菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)小鼠抑郁行為的影響。方法將18只小鼠隨機(jī)分為模型組、治療組和對(duì)照組，每組6只。模型組與治療組首先采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)溶液灌腸的方法建立小鼠UC模型，模型組正常喂養(yǎng)2 d，而治療組在造模后4 h腹腔注射3.2 mg/kg CZLC331蛋白；對(duì)照組采用380 ml/L乙醇溶液灌腸1次，正常喂養(yǎng)2 d。比較三組小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)時(shí)間、小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)時(shí)間、小鼠糖水偏愛百分比。結(jié)果在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中，治療組小鼠不動(dòng)時(shí)間[(64.7±10.4)s，(62.5±13.9)s]均低于模型組[(86.7±16.0)s，(111.3±41.1)s]，并且高于對(duì)照組[(21.0±5.3)s，(16.0±8.3)s]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在糖水偏愛實(shí)驗(yàn)中，治療組小鼠糖水偏愛(66.5±7.3)%高于模型組(34.5±4.6)%，低于對(duì)照組(77.2±7.7)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論細(xì)菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331可以有效改善UC小鼠的抑郁程度。

【關(guān)鍵詞】潰瘍性結(jié)腸炎；CZLC331；小鼠；抑郁

通訊作者:劉海峰, E-mail:haifengliu333@163.com

作者簡(jiǎn)介：暢海升，碩士，主治醫(yī)師，E-mail:hassion001@163.com

【中國(guó)圖書分類號(hào)】R574.6

Effect of flagellum protein derivative CZLC331 on the depressive behavior of mice with ulcerative colitis

WANG Huan1, XU Yang1, QU Yawei1, ZHANG Chenggang2, and LIU Haifeng1.1.Department of Gastroenterology, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China; 2.Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences; State Key Laboratory of Proteomics; Research Center for Military Cognition and Mental Hygiene of Chinese PLA, Beijing 100850, China

Abstract【】ObjectiveTo study the effect of flagellum protein derivative CZLC331 on the depressive behavior of mice with ulcerative colitis. MethodsUC mice model was established by TNBS enema. Eighteen SPF male Balb/c mice were randomly and equally divided into the control group, UC model group, and CZLC331 treatment group, six mice in each group. Mice depression index was observed by forced swimming test, tail suspension experiment and sugar water consumption experiment. ResultsFor the forced swimming test and tail suspension test, the immobility time in treated mice [(64.7±10.4)s，(62.5±13.9)s]was significantly lower than in the model group[(86.7±16.0)s，(111.3±41.1)s], and significantly higher than in the control group[(21.0±5.3)s，(16.0±8.3)s]. In sugar water consumption experiment, the percentage of sucrose preference in treated mice (66.5±7.3)% was significantly higher than in model group(34.5±4.6)%, and significantly lower than in the control group(77.2±7.7)%. ConclusionsCZLC331 can effectively improve the level of depression in mice with ulcerative colitis.

【Key words】ulcerative colitis； cZLC331；mouse；depression

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種病因尚未完全明確的慢性非特異性炎性腸病，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液便和血便，并伴有多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)炎、骨質(zhì)疏松等腸外表現(xiàn)[1-3]。近年來，國(guó)內(nèi)外研究表明，UC 患者多合并精神心理異常，如焦慮和抑郁等，而且這些異常的心理因素會(huì)延長(zhǎng)病程，誘導(dǎo)疾病復(fù)發(fā)[3]，細(xì)菌鞭毛蛋白是一種抗原物質(zhì)，鞭毛抗原又稱 H 抗原,是5型Toll-like受體(TLR5)激動(dòng)劑。筆者采用常規(guī)原核表達(dá)方法制備了一種沙門菌鞭毛蛋白衍生物，命名為CZLC331。前期研究顯示，鞭毛蛋白衍生物CZLC331對(duì)UC小鼠具有明顯的治療作用[4]。但鞭毛蛋白衍生物是否也能改善UC患者的抑郁等精神異常，國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。本研究以三硝基苯磺酸( TNBS) /乙醇建立小鼠 UC 動(dòng)物模型，旨在研究CZLC331對(duì)UC模型小鼠抑郁行為的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性Balb/c小鼠18只，6～8周齡，體重18～22 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2主要試劑2,4,6-三硝基苯磺酸(Sigma公司)、液體石蠟(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司) 、RT-PCR試劑盒(貨號(hào)FSK100，購(gòu)自東洋紡生物科技有限公司)、ELISA試劑盒(松原公司)。

1.1.3主要儀器VMR小動(dòng)物麻醉機(jī)(北京益仁恒業(yè)科技有限公司)，小鼠灌胃針(北京健力園醫(yī)療器械有限公司)，超凈工作臺(tái)(YZ-875，蘇州)，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)， PCR擴(kuò)增儀(GeneAmp，美國(guó))，低溫冰箱(SANYO，日本)，電泳儀(Bio-rad，美國(guó))，渦旋混合器(江蘇)，Gene genius凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó))。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組將18只小鼠隨機(jī)分為模型組、治療組和對(duì)照組，每組6只小鼠。前兩組首先采用TNBS溶液灌腸的方法建立小鼠UC模型，治療組在UC形成后4 h，腹腔注射3.2 mg/kg CZLC331，模型組正常喂養(yǎng)2 d。對(duì)照組是針對(duì)正常小鼠用以上方法將380 ml/L乙醇溶液灌腸1次，正常喂養(yǎng)2 d。

1.2.2模型制備首先將小鼠采用麻醉機(jī)麻醉，然后用直徑2.0 mm長(zhǎng)約5 cm的灌胃針由肛門輕緩插入(深約3 cm)并將灌腸試劑(含有150 g/L TNBS+380 ml/L乙醇溶液, 150 mg/kg)緩慢推入結(jié)腸以制備炎性腸病模型。

1.2.3CZLC331的制備首先構(gòu)建沙門菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331的原核表達(dá)載體pET28b-Tat-CZLC331，然后對(duì)原核表達(dá)載體pET28b-Tat-CZLC331進(jìn)行轉(zhuǎn)化及菌體復(fù)蘇，再對(duì)原核表達(dá)載體pET28b-Tat-CZLC331進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，制備沙門菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白樣品，最后對(duì)沙門菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白樣品進(jìn)行分離、純化得到沙門菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白，純度達(dá)95%以上。

1.2.4抑郁指數(shù)分析

1.2.4.1強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)灌腸前1 d，小鼠適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，將小鼠放入高20 cm，直徑15 cm的圓柱形游泳缸中，水溫25 ℃，水深10 cm，15 min后將小鼠取出。灌腸后每天進(jìn)行一次強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，共21 d。實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠在缸內(nèi)游泳6 min，記錄后4 min內(nèi)小鼠的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)時(shí)間是指小鼠在水中停止掙扎呈漂浮狀態(tài)，或僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面的時(shí)間。

1.2.4.2懸尾實(shí)驗(yàn)小鼠灌腸后每天進(jìn)行一次懸尾實(shí)驗(yàn)，共21 d。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠尾部用膠帶纏繞，松緊以不影響小鼠尾部血液循環(huán)為標(biāo)準(zhǔn)，將小鼠倒掛，用夾子夾住膠帶邊緣，保證小鼠尾部不會(huì)因夾子固定而產(chǎn)生疼痛的感覺，將夾子固定于懸尾箱頂端，記錄小鼠在6 min中不動(dòng)時(shí)間。

1.2.4.3糖水偏愛實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前訓(xùn)練小鼠適應(yīng)飲糖水，每籠同時(shí)放置2個(gè)水瓶，第一個(gè)24 h，2瓶均裝有1%蔗糖水，隨后的24 h，一瓶裝1%蔗糖水，另一瓶裝純水。在實(shí)驗(yàn)的第2天進(jìn)行糖水偏愛實(shí)驗(yàn)，同時(shí)給予每只小鼠事先定量好的2瓶水(1瓶1%蔗糖水和1瓶純水)，處死小鼠前，取2瓶水稱量。記錄動(dòng)物的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗，計(jì)算糖水偏愛 (糖水消耗/總液體消耗×100%)。若模型組小鼠的糖水偏愛明顯低于對(duì)照組或治療組小鼠，說明其出現(xiàn)抑郁樣行為。

2　結(jié)　　果

在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中，治療組小鼠不動(dòng)時(shí)間均明顯低于模型組，并且高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。在糖水偏愛實(shí)驗(yàn)中，治療組小鼠糖水偏愛明顯高于模型組，并且低于對(duì)照組(P均<0.01，表1)。

表1　細(xì)菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331

注：治療組在UC形成后4 h，腹腔注射3.2 mg/kg CZLC331，模型組正常喂養(yǎng)2 d；對(duì)照組是針對(duì)正常小鼠將380 ml/L乙醇溶液灌腸1次，正常喂養(yǎng)2 d。與對(duì)照組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01

3　討　　論

UC是嚴(yán)重影響人類健康的疾病。由于UC的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，因而在臨床上無法針對(duì)病因進(jìn)行有效的治療。從1888年至今，5-氨基水楊酸始終是UC的一線治療藥物，但其治療效果并不理想，即使在發(fā)病率較高的歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，也并無治療UC的特效藥[5]。隨著病情的惡化，往往不得不進(jìn)行全結(jié)腸切除術(shù)，給患者帶來了極大的痛苦。

近年來，國(guó)內(nèi)外研究表明，UC 患者多合并精神心理異常，如焦慮和抑郁等，而且這些異常的心理因素會(huì)延長(zhǎng)病程，誘導(dǎo)疾病復(fù)發(fā)。H?user等[6]研究發(fā)現(xiàn)，精神心理異常在緩解期、輕度和中重度UC的發(fā)生率分別為 11.3%、27.7% 和 49.3% ，Cheng等[7]研究也表明，重度UC較輕中度UC的焦慮和抑郁更加明顯。因此，許多臨床醫(yī)師對(duì)UC進(jìn)行抗焦慮/抑郁治療，但目前國(guó)內(nèi)外系統(tǒng)的臨床研究很少，且其療效一直存在爭(zhēng)議。

細(xì)菌鞭毛蛋白是一種抗原物質(zhì)，是5型Toll-like受體(TLR5)激動(dòng)劑，對(duì)TLR5-NF-κB信號(hào)通路具有激活作用，與TLR家族信號(hào)通路具有密切關(guān)系。Toll 樣受體( Toll like receptors，TLR) 家族是一類參與病原微生物引起的先天免疫的蛋白受體家族。近年來 TLR 在機(jī)體免疫應(yīng)答中的作用受到高度關(guān)注。TLR不僅在激活天然免疫中發(fā)揮重要作用，而且還在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)獲得性免疫中具有重要意義，是連接天然免疫和獲得性免疫的重要橋梁[8，9]。目前已發(fā)現(xiàn) 13 種TLR，細(xì)菌鞭毛蛋白是目前已知的惟一的 TLR5特異性配體。既往研究表明在放射損傷小鼠模型中，鞭毛蛋白衍生物對(duì)造血系統(tǒng)及胃腸道系統(tǒng)均表現(xiàn)出較顯著的保護(hù)作用[10-11]。

筆者采用常規(guī)原核表達(dá)方法制備了一種沙門菌鞭毛蛋白衍生物，命名為CZLC331，包括Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽、沙門氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸殘基和第402-505位氨基酸殘基的融合蛋白，自N端第1-176位氨基酸殘基和第402-505位氨基酸殘基可通過柔性連接肽連接，純度大于95%。筆者前期研究顯示，CZLC331對(duì)UC小鼠具有明顯的治療效果。但鞭毛蛋白衍生物是否也能改善UC小鼠的抑郁行為，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，通過腹腔注射CZLC331對(duì)小鼠UC模型進(jìn)行治療，明顯影響UC小鼠的抑郁行為，小鼠抑郁指數(shù)明顯降低。與模型組比較，治療組游泳及懸尾實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間明顯縮短，而糖水偏愛程度明顯增加。

綜上所述，細(xì)菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331可以明顯影響UC小鼠的抑郁行為，并且有效改善UC小鼠的抑郁程度，但機(jī)制不明確，是否與調(diào)節(jié)白介素家族和腫瘤壞死因子的水平有關(guān)，是否與TLR-NF-κB通路存在一定聯(lián)系，是否與治療UC的機(jī)制是同一機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1]孔磊,王威,孫景武, 等. 潰瘍性結(jié)腸炎的研究進(jìn)展[J]. 臨床薈萃, 2009, 9(24): 823-825.

[2]Yamamoto-Furusho J K, Uscanga L F, Vargas -Alarcón G,etal. Clinical and genetic heterogeneity in Mexican patients with ulcerative colitis[J]. Hum Immunol,2003,64(1):119-123.

[3]Campieri M , Gionchetti P. Bacteria as the cause of ulcerative colitis [J]. Gut, 2001, 48(1): 132-135.

[4]王寰, 徐陽(yáng), 屈亞威, 等. 細(xì)菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331治療小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的療效[J]. 世界華人消化雜志，2014, 22(30): 4573-4577.

[5]Burdelya LG, Krivokrysenko V I, Tallant T C,etal．An agonist of toll-like receptor 5 has radioprotective activity in mouse and primate models[J]．Science,2008，320(5873):226-230.

[6]H?user W，Janke K H，Klump B，etal．Anxiety and depression in pa- tients with inflammatory bowel disease: comparisons with chronic liver disease patients and the general population [J]．Inflamm Bowel Dis，2011,17(2):621-632.

[7]Cheng W F，Shi R H．Investigation on psychological characteristics in ulcerative colitis[J]．Chin J Gastroenterol Hepatol，2007,16(5):437-439.

[8]Hossain M S, Gewirtz A T, Roback J D,etal．Flagellin A TLR5 agonist, facilitates production of foxp3+CD4+CD25+regulatory T cells to maintain balanced immune reconstitution in allogeneic BMT without GvHD[J]．Biol Blood Marrow Tr, 2009,15(2):12-15.

[9]Lyudmila G, Burdelya , Tallant T C,etal. An agonist of Toll-like receptor 5 has radioprotective activity in mouse and primate models [J] . Science, 2008,320(5873):226-230.

[10]Vijay-Kumar M , Aitken J D, Sanders C J,etal．Flagellin treatment protects against chemicals, bacteria, viruses, and radiation[J]．lmmunol, 2008,180(12):8280- 8285.

[11]Jackson L N, Zhou Y N, Qiu S M,etal. Alternative medicine products as a novel treatment strategy for inflammatory bowel disease[J]. Am J Chin Med, 2008,36(5):953-965.

(2015-02-08收稿2015-03-06修回)

(責(zé)任編輯武建虎)