高糖激活Ca2+-CaN-NFAT3信號(hào)通路致H9c2細(xì)胞肥大

徐小紅1△，阮駱陽1，田小華1，潘鳳娟1，楊彩蘭2,柳國(guó)勝2

(1廣東省農(nóng)墾中心醫(yī)院兒科，廣東 湛江 524002;2暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院兒科，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討不同高糖濃度培養(yǎng)H9c2細(xì)胞是否引起心肌細(xì)胞肥大，探討Ca2+-CaN-NFAT3信號(hào)通路是否參與高糖引起H9c2心肌細(xì)胞肥厚過程。方法: 體外培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞48 h，分為5 mmol/L糖對(duì)照組、25mmol/L糖培養(yǎng)組、50 mmol/L糖培養(yǎng)組、25mmol/L糖培養(yǎng)加L型鈣通道阻滯劑苯磺酸氨氯地平[商品名絡(luò)活喜(Norvasc)]組和50 mmol/L糖培養(yǎng)加Norvasc組5組。觀察H9c2細(xì)胞形態(tài)并測(cè)量細(xì)胞表面積大??；熒光分光光度法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度 [Ca2+]i；ELISA測(cè)細(xì)胞內(nèi)CaN濃度；real-time PCR法及Western blot檢測(cè) CaNAβ、NFAT3和β-MHC的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果: 細(xì)胞大小、單細(xì)胞平均[Ca2+]i測(cè)定熒光值及細(xì)胞內(nèi)CaN濃度在隨糖濃度升高呈階梯上升，50 mmol/L時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。加入Norvasc后細(xì)胞大小較相同條件不加Norvasc者降低。CaNAβ、 NFAT3和β-MHC的mRNA及蛋白表達(dá)隨糖濃度升高逐步升高，50 mmol/L時(shí)達(dá)最高。加入Norvasc后CaNAβ、 NFAT3和β-MHC的mRNA及蛋白表達(dá)均較未加Narvasc組明顯降低。結(jié)論: 高糖通過激活Ca2+-CaN-NFAT3信號(hào)通路引起H9c2心肌細(xì)胞肥大。

[關(guān)鍵詞]妊娠期糖尿病； 心肌細(xì)胞肥大； 氨氯地平； 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶; 活化T細(xì)胞核因子3

[中圖分類號(hào)]R363[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.015

[文章編號(hào)]1000-4718(2015)11-2021-06

[收稿日期]2015-04-30[修回日期] 2015-09-07

[基金項(xiàng)目]*國(guó)家自然青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81300705;No.81300676; No.81370909)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(No.12ykpy41);廣東省實(shí)驗(yàn)體系建設(shè)項(xiàng)目基金(No.2012A061400004)

通訊作者△Tel: 020-85252107； E-mail: xufen3@mail.sysu.edu.cn

High glucose induces H9c2 cardiomyocyte hypertrophy through Ca2+-CaN-NFAT3 signaling pathwayXU Xiao-hong1, RUAN Luo-yang1, TIAN Xiao-hua1, PAN Feng-juan1, YANG Cai-lan1， LIU Guo-sheng2

(1DepartmentofPediatrics,CentralHospitalofGuangdongAgriculturalReclamation,Zhanjiang524002,China;2DepartmentofPediatrics,theFirstClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail: 276798575@qq.com)

ABSTRACT[]AIM: To study the morphological changes of cardiac H9c2 cells during the developmental process of fetal rat. METHODS: Embryonic rat heart-derived H9c2 cells were maintained in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum. The H9c2 cells were plated at a density of 6 000 cells/cm and divided into 5 groups: H9c2 cells were treated with 5 mmol/L glucose, 25 mmol/L glucose, 50 mmol/L glucose, Norvasc (25 nmol/L)+25 mmol/L glucose, or Norvasc (25 nmol/L)+50 mmol/L glucose for 48 h. The morphology of H9c2 cells was observed. The cell surface area was measured by Image-Pro Plus 6.1 software. Fluorescence spectrophotometry was used to detect the concentration of intracellular calcium ion ([Ca2+]i)in the cardiomyocytes. The concentration of CaN in the cell was measured by ELISA. The mRNA expression of CaNAβ, NFAT3 and β-MHC in the cells was detected by real-time PCR. The protein levels of CaNAβ, NFAT3 and β-MHC in cultural H9c2 cells were detected by Western blot. RESULTS: The mean area of the cells, the mean fluorescence value of [Ca2+]i and the concentration of CaN in 25 mmol/L glucose group were higher than those in 5 mmol/L glucose group, and those were lower than those in 50 mmol/L glucose group. After treated with Norvasc, those results decreased significantly. The expression of CaNAβ, NFAT3 and β-MHC at mRNA and protein levels in 25 mmol/L glucose group was higher than those in 5 mmol/L glucose group, but was lower than those in 50 mmol/L glucose group . The expression of CaNAβ, NFAT3 and β-MHC at mRNA and protein levels decreased significantly in Norvasc treatment group. CONCLUSION: Ca2+-CaN-NFAT3 signaling pathway is perhaps involved in high glucose- induced H9c2 cardiomyocyte hypertrophy.

[KEY WORDS]Gestational diabetes mellitus; Cardiomyocyte hypertrophy; Amlodipine; Calcineurin; Nuclear factor of activated T cells 3

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)指“妊娠期或妊娠前發(fā)生的任何程度或首次識(shí)別葡萄糖耐受不良”[1]。GDM孕婦胎兒心臟畸形發(fā)生率高于一般孕婦胎兒6～8倍[2]，包括動(dòng)脈導(dǎo)管未閉、肺動(dòng)脈狹窄及室間隔肥厚等發(fā)育異常，其中心肌肥厚是心血管意外事件發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可對(duì)胎兒的發(fā)育造成嚴(yán)重的不良后果，甚至影響其成年后的生活質(zhì)量[3-4]。GDM孕婦所生的新生兒10%～20%可有心臟擴(kuò)大，新生兒肥厚性心肌病的發(fā)生與孕婦血糖控制不理想有獨(dú)立相關(guān)性，超聲心動(dòng)檢查顯示心肌肥厚，室間隔增厚，心臟擴(kuò)大，嚴(yán)重者將會(huì)發(fā)生心力衰竭。高血糖致心肌病的特點(diǎn)是心肌結(jié)構(gòu)改變，而最終導(dǎo)致心力衰竭的是心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變。目前認(rèn)為多種機(jī)制參與其中，包括改變心肌能量代謝和鈣信號(hào)；但高血糖致胎兒心肌改變的具體機(jī)制尚不明確。本研究從鈣信號(hào)通路角度研究GDM中胎兒發(fā)生心肌肥厚的可能發(fā)病機(jī)制，以期為臨床防治此種疾病提供理論依據(jù)并發(fā)現(xiàn)可能作用靶點(diǎn)。

材料和方法

1材料

大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；D-葡萄糖購(gòu)自廣州化學(xué)試劑；絡(luò)活喜(Norvasc；即苯磺酸氨氯地平，amiodipine besylate)由Sigma提供；胎牛血清(HyClone)；DMEM高、低糖培養(yǎng)基(Gibco)；PBS磷酸鉀緩沖液(HyClone)；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司；鈣離子熒光探針Fluo-3 AM(碧云天)；DNase I(RNase-free)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR試劑盒(Vazyme)；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶Aβ(calcineurin Aβ，CaNAβ)、活化T細(xì)胞核因子3(nuclear factor of activated T cells 3，NFAT3)和β-重鏈肌球蛋白(β-myosin heavy chain，β-MHC) I 抗購(gòu)自Abcam。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞解凍后，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，5% CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)共分為5組，分別為5 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L糖處理組及Norvasc與25 mmol、50 mmol/L糖共處理組。

2.3細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)的測(cè)定Fluo-3經(jīng)無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至2 μmol/L；去除舊細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞，先后于37 ℃、5% CO2予2 μmol/L的Fluo-3孵育1 h、30 min；棄去Fluo-3，PBS洗滌細(xì)胞2次，加培養(yǎng)基適量后熒光顯微鏡檢測(cè)。

2.4細(xì)胞內(nèi)CaN濃度的測(cè)定按酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒操作步驟操作。

2.5熒光定量PCR法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞CaNAβ、NFAT3和β-MHC的mRNA表達(dá)用 TRIzol 試劑盒(Invitrogen)提取 RNA ；使用RNase-free的DNase Ⅰ配置反應(yīng)液，37 ℃消化30 min，65 ℃滅活10 min去DNA，加入模板RNA、引物混合物42 ℃逆轉(zhuǎn)錄1 h，冰上2 min；cDNA稀釋10倍后，作為PCR模板加入引物反應(yīng)體系，95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s；40個(gè)循環(huán)，在溫度60 ℃、95 ℃行融解曲線分析。GAPDH的上游引物序列為5’-CATCAACGACCCCTTCATTG-3’， 下游引物序列為5’-GAAGATGGTGATGGGTTTCC-3’；CaNAβ的上游引物序列為5’-ATGTTGCCTAGTGGAGTGTT-3’， 下游引物序列為5’-GGAGAGTATCCTCGTATTGCTT-3’； NFAT3的上游引物序列為5’-CCACAAGGCATTGAGACACAT-3’， 下游引物序列為5’-TCACCAGCAGCAGCAGCAG-3’；β-MHC的上游引物序列為5’-AATGAACACCGGAGCAAGG-3’，下游引物序列為5’-CGGGTCAGCTGAGAGATAAGAGC-3’。

2.6Western blot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞CaNAβ、NFAT3和β-MHC蛋白的表達(dá)預(yù)冷的PBS沖洗培養(yǎng)孔板中的H9c2細(xì)胞后立即放入預(yù)冷的裂解緩沖液中30 min，裂解產(chǎn)物10 000 r/min離心20 min，取上清。吸取2 μL上清液用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，制備10 mL 10% SDS-PAGE分離膠，凝固后配制5%濃縮膠5 mL灌滿剩余空間，每孔上樣50 μg。用100 V恒壓濃縮膠電泳20 min，恒壓140 V分離膠電泳40 min。將凝膠中已分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBS洗滌3次, 傾去TBS后加封閉液置搖床室溫封閉2 h；膜放入封閉液稀釋 I 抗中室溫反應(yīng)4 h后4 ℃過夜，大量PBST洗膜3次，洗滌后將PVDF膜放入 II抗中室溫?fù)u床2 h。取出PVDF膜, PBS洗5次, 每次15 min。ECL發(fā)光法顯影。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)兩兩之間采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1細(xì)胞表面積分析

使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，可見各組不同條件分別培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞大小隨糖濃度升高逐步上升，50 mmol/L時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。加入Norvasc后細(xì)胞大小較相同條件不加Norvasc者降低，但與5 mmol/L glucose組比較，細(xì)胞大小改變的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

Figure 1.The mean surface area of the H9c2 cells in each group. The cells were treated with 5 mmol/L glucose (A), 25 mmol/L glucose (B), 50 mmol/L glucose (C), Norvasc+25 mmol/L glucose (D), or Norvasc+50 mmol/L glucose (E) for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsgroup A;△P<0.05vsgroup B;▲P<0.05vsgroup C.

圖1各組細(xì)胞表面積大小的測(cè)量結(jié)果

2各組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i活性測(cè)定結(jié)果

各組不同條件分別培養(yǎng)48 h后，單細(xì)胞平均[Ca2+]i活性測(cè)定熒光值隨糖濃度升高逐步上升，50 mmol/L時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)(P<0.05)。加入Norvasc后單細(xì)胞平均[Ca2+]i活性測(cè)定熒光值較相同條件不加Norvasc者降低(P<0.05)，見圖2。

3各組細(xì)胞CaN濃度的測(cè)定

各組不同條件分別培養(yǎng)48 h后，其余各組CaN濃度均較5 mmol/L時(shí)糖濃度組升高(P<0.05)；CaN濃度隨糖濃度升高呈階梯上升(P<0.05)。加入Norvasc后CaN濃度較相同條件不加Norvasc者降低(P<0.05)，見圖3。

4Real-time PCR檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞CaN、NFAT3和β-MHC mRNA的變化

各組不同條件分別培養(yǎng)48 h后，CaN、NFAT3及β-MHC的mRNA表達(dá)隨糖濃度升高呈階梯上升，50 mmol/L時(shí)表達(dá)最多。加入Norvasc后， CaN的mRNA表達(dá)均明顯降低，見圖4。

Figure 2.The fluorescence images of [Ca2+]iin the H9c2 cells with different treatments (×200) and the quantitative analysis of the mean fluorescence intensity of [Ca2+]iin each group. The definition of the grouping was the same as Figure 1. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsgroup A;△P<0.05vsgroup B;▲P<0.05vsgroup C.

圖2各組[Ca2+]i熒光染色觀察和各[Ca2+]i熒光值的測(cè)定結(jié)果

5Western blot檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞CaN、NFAT3和β-MHC蛋白的表達(dá)

各組不同條件分別培養(yǎng)48 h后，CaN、NFAT3及β-MHC蛋白表達(dá)隨糖濃度升高逐步上升，50 mmol/L組達(dá)到最高點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入Norvasc后，各蛋白表達(dá)均明顯降低，見圖5。

討論

高血糖持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短是糖尿病心肌病造成心力衰竭嚴(yán)重程度的重要標(biāo)尺[5]，故將高血糖作為造成糖尿病心肌損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素來研究[6]。H9c2細(xì)胞來源于大鼠胚胎心室肌克隆培養(yǎng)的心臟成肌細(xì)胞，有文獻(xiàn)證實(shí)氧化應(yīng)激條件下H9c2細(xì)胞具有的應(yīng)答反應(yīng)相似于原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞[7]。因其來源于大鼠胚胎的心肌細(xì)胞，更能直接反映胚胎心臟的生理病理狀態(tài)，所以我們用其來研究GDM中大鼠胚胎在持續(xù)高血糖環(huán)境下心肌細(xì)胞發(fā)生的可能改變。

CaN-NFAT3信號(hào)通路在心臟發(fā)育發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。有研究人員[8]發(fā)現(xiàn)，CaN-NFAT3信號(hào)在小鼠胚胎E9即啟動(dòng)了心臟瓣膜的形成過程，E11在心內(nèi)膜中參與指導(dǎo)瓣膜狀小葉的重塑，這種連續(xù)的心肌層-心內(nèi)膜信號(hào)協(xié)調(diào)了各種分子和細(xì)胞事件以確保瓣膜形成過程的起始和延續(xù)。相較CaN-NFAT3信號(hào)通路在胚胎心血管發(fā)育過程中的作用，其在心肌肥大中所扮演的角色則更受人關(guān)注，也了解得更為透徹。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是由一個(gè)催化亞單位(CnA)和一個(gè)調(diào)節(jié)亞單位(CnB)組成的異二源體，在CnA的α、β和γ 3種亞型中，在心臟中介導(dǎo)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性與CnAβ亞型有關(guān)，與CnAα和CnAγ無關(guān)[9]。Ca2+/鈣調(diào)素(calmodulin，CaM)-calcineurin (CnAβ)-NFAT3組成鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號(hào)通路。多項(xiàng)研究[10-11]認(rèn)為:多種病因均能使心肌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度增加，激活的Ca2+/CAM依賴的CaN，在依賴Ca2+和CaN的通路里去磷酸化胞漿中的轉(zhuǎn)移NFAT3，暴露其上的核定位信號(hào)，并需要GATA等配偶體的協(xié)助來完成核轉(zhuǎn)運(yùn)[12]，轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核，活化多種心肌肥大的相關(guān)基因調(diào)節(jié)心臟中的心房利鈉因子(atrial natriuretic factor，ANF)、腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)、β重鏈肌球蛋白(β-MHC)等肥大基因特異性表達(dá)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞蛋白核酸合成增加，心肌細(xì)胞體積增大，形成心肌肥大。

Figure 3.The concentration of CaN in the H9c2 cells with different treatments detected by ELISA. The definition of the grouping was the same as Figure 1. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsgroup A;△P<0.05vsgroup B;▲P<0.05vsgroup C.

圖3ELISA測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)CaN濃度的結(jié)果

Figure 4.The mRNA expression in the H9c2 cells with different treatments detected by real-time PCR. The definition of the grouping was the same as Figure 1. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsgroup A;△P<0.05vsgroup B;▲P<0.05vsgroup C.

圖4Real-time PCR檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞CaNAβ、NFAT3和β-MHC的mRNA表達(dá)

Figure 5.The protein levels in the H9c2 cells with different treatments detected by Western blot analysis. The definition of the grouping was the same as Figure 1. β-actin is the same.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsgroup A;△P<0.05vsgroup B;▲P<0.05vsgroup C.

圖5Western blot檢測(cè)各組CaNAβ、 NFAT3和β-MHC的蛋白表達(dá)

細(xì)胞內(nèi)游離鈣作為第二信使廣泛參與細(xì)胞生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)過程。鈣離子濃度對(duì)于該信號(hào)通路的影響是顯而易見的，Somvanshi等[13]提供了直接的證據(jù)證明生長(zhǎng)抑素受體2(somatostatin receptor-2，SSTR2)通過調(diào)節(jié)Ca2+相關(guān)的致心肌肥厚的信號(hào)途徑來保護(hù)心臟。Hsu等[14]發(fā)現(xiàn)壓力超負(fù)荷早期釋放心肌肥厚早期的信號(hào)Egr1(early growth response 1)誘導(dǎo)Cav3.2通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-NFAT信號(hào)通路調(diào)節(jié)心肌肥大。我們選擇用不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)H9c2來探索高糖對(duì)其存活、生長(zhǎng)的可能影響，并利用加入L型鈣通道阻滯劑苯磺酸氨氯地平來探討Ca2+在其中的可能作用及主要信號(hào)途徑，以期探索并發(fā)現(xiàn)影響胎兒心臟發(fā)育的關(guān)鍵影響因素并提供可能的治療干預(yù)對(duì)策，爭(zhēng)取為以后臨床發(fā)展提供理論依據(jù)。

我們的研究發(fā)現(xiàn)高糖可導(dǎo)致H9c2細(xì)胞平均單個(gè)細(xì)胞體積增加，為進(jìn)一步研究這種肥大可能通過何種信號(hào)通路來完成，我們檢測(cè)了其中的CaNAβ、NFAT3及β-MHC的mRNA及蛋白表達(dá)，并采用ELISA檢測(cè)CaN總的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它們的變化趨勢(shì)一致，均隨培養(yǎng)糖濃度的增加而增加，并隨濃度進(jìn)一步增高而增高，提示兩者具有相關(guān)性。因已有的認(rèn)識(shí)證明CaN的激活主要依賴胞漿內(nèi)Ca2+濃度的升高，它的活性受細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化所調(diào)節(jié)，所以鈣離子通道抑制劑也是目前心肌肥厚一個(gè)研究熱點(diǎn)和重要的治療靶點(diǎn)。L型鈣通道抑制劑Norvasc被用來反證高糖培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞中Ca2+是否存在內(nèi)流，引起[Ca2+]i的變化并激活CaN，從而激活信號(hào)通路最終致心肌細(xì)胞肥大。我們發(fā)現(xiàn)，使用Norvasc后細(xì)胞內(nèi)鈣活性明顯降低，CaN濃度明顯降低及CaNAβ、NFAT3及β-MHC的mRNA及蛋白表達(dá)也明顯降低，提示Ca2+參與了CaNAβ-NFAT3信號(hào)通路的激活，Ca2+尤其是細(xì)胞內(nèi)鈣在高糖培養(yǎng)致H9c2細(xì)胞肥大中可能發(fā)揮了重要作用。但心肌肥大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制非常復(fù)雜， Liu等[15]提供了與LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和鏈接的CaN-NFAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)心肌肥厚發(fā)展的相關(guān)證據(jù)，他們使用了信號(hào)通路中多個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)的抑制劑，證明鈣調(diào)磷酸酶抑制劑顯著抑制了NFAT3核定位，證實(shí)了LPS通過CaN-NFAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致H9c2細(xì)胞的心肌肥厚。該研究提供了我們下一步研究的思路。

總而言之，根據(jù)我們的研究，有理由認(rèn)為高糖培養(yǎng)可能通過激活Ca2+-CaN-NFAT3信號(hào)通路而導(dǎo)致H9c2細(xì)胞肥大，鈣離子通道抑制劑Norvasc可以抑制這種作用。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)