激活Nodal信號通路促進小鼠胚胎干細胞向定型內(nèi)胚層分化*

鐘娃，夏忠勝，歐陽慧，袁宇紅，于濤，單體棟，陳其奎△

(中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院消化內(nèi)科 ，廣東 廣州 510120)

[摘要]目的： 探討激活Nodal信號通路在小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESC)向定型內(nèi)胚層(definitive endoderm，DE)分化中的作用，尋找小鼠ESC向DE分化的最佳培養(yǎng)體系。方法: 根據(jù)培養(yǎng)基的不同，實驗分為3組:胚胎干細胞組(基礎(chǔ)培養(yǎng)+LIF)、自然分化組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)和activin A組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+50 μg/L activin A)。細胞培養(yǎng)1～7 d， 收集不同作用時點(1、3、5、7 d)的細胞及細胞爬片。用流式細胞術(shù)檢測CXCR4陽性細胞的比例；免疫細胞化學(xué)法檢測CXCR4蛋白的表達；Western blot檢測OCT4及CXCR4蛋白的表達。結(jié)果: 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果提示，隨著培養(yǎng)時間的延長，CXCR4陽性細胞的比例，胚胎干細胞組在1～7 d無明顯變化，自然分化組和activin A組逐漸增高，第5天達高峰(P<0.05)，其中activin A組最高(P<0.05)。細胞免疫組化結(jié)果顯示CXCR4陽性細胞呈棕褐色或棕黃色。Western blot的結(jié)果提示，隨著培養(yǎng)時間的延長，胚胎干細胞組OCT4和CXCR4蛋白表達無明顯變化；自然分化組和activin A組的CXCR4蛋白的表達逐步增高，OCT4蛋白的表達逐步下降，第5天達高峰(P<0.05)，其中 activin A組的表達最明顯(P<0.05)。結(jié)論: 在小鼠ESC分化過程中，在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第5天, DE的比例最高。激活Nodal信號通路可以促進小鼠ESC向具有CXCR4分子標志的DE分化，有利于獲取更多的DE細胞。

[關(guān)鍵詞]Nodal信號通路； 小鼠胚胎干細胞； 定型內(nèi)胚層； 細胞分化

[中圖分類號]Q291； R363[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.024

[文章編號]1000-4718(2015)11-2076-07

[收稿日期]2015-06-10[修回日期] 2015-07-14

[基金項目]*北京市自然科學(xué)基金資助項目(No.7152061)

通訊作者△Tel： 010-85231240； E-mail： zhoujunlin@medmail.com.cn

Promoting effects of activated Nodal signal pathway on definitive endoderm induction from mouse embryonic stem cellsZHONG Wa, XIA Zhong-sheng, OU-YANG Hui, YUAN Yu-hong, YU Tao, SHAN Ti-dong, CHEN Qi-kui

(DepartmentofGastroenterology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:qkchen@21cn.com)

ABSTRACT[]AIM: To study the process of promoting mouse embryonic stem cells (ESC) to specify to definitive endoderm by up-regulating of Nodal signal pathway in order to find the best cultivated systems of differentiation of mouse ESC to definitive endoderm cells. METHODS: The cells were divided into different groups based on the culture medium: ESC group (serum-free medium + LIF), natural differentiation group (serum-free medium) and activin A group (serum-free medium + 50 μg/L activin A). The cells and the sterilized coverslips with cells were collected at 1, 3, 5 and 7 d of the cultivation. The proportion of CXCR4+ cells was detected by flow cytometry. The expression of CXCR4 was determined by immunocytochemical method, and the protein expression of OCT4 and CXCR4 was detected by Western blot. RESULTS: The proportion of CXCR4+ cells showed no dramatic change in ESC group along with the extending of cultivation day, while there were gradually increased in natural differentiation group and activin A group and the highest level was observed at 5 d. Among the 3 groups, the proportion of CXCR4+ cells at 5 d was the highest in activin A group. The brown or tan staining in the cells observed under microscope was considered as positive CXCR4 by immunocytochemistry. The protein levels of OCT4 and CXCR4 in ESC group along with the extending of cultivation days was observed. The expression levels of OCT4 were gradually decreased in the cells in natural differentiation group and activin A group, while those of CXCR4 were gradually increased with the highest level at 5 d. It was highest in the cells in activin A group. CONCLUSION: The proportion of definitive endoderm was the highest at 5 d of the induction during in vitro mouse ESC differentiation. Up-regulation of Nodal signal pathway by adding activin A at the early stage of mouse ESC differentiation promotes mouse ESC to specify to definitive endoderm with CXCR4 molecular marker.

[KEY WORDS]Nodal signal pathways; Mouse embryonic stem cells; Definitive endoderm; cell differentiation

胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESC)具有多向分化潛能，可以分化為外胚層、中胚層以及內(nèi)胚層細胞。其中內(nèi)胚層在發(fā)育過程中逐漸分化為定型內(nèi)胚層(definitive endoderm，DE)以及臟內(nèi)胚層(visce-ral endoderm)。DE 隨著胚胎的發(fā)育，形成原始消化道及與消化道相關(guān)的臟器組織，如肝臟、胰腺等等消化器官[1-2]。DE可以作為肝細胞、胰腺細胞及腸道上皮細胞的共同前體細胞群，進行體外定向誘導(dǎo)分化。Kim等[3]研究者以ESC來源的DE為前體細胞，通過BMP-4的誘導(dǎo)和Wnt信號通路的上調(diào)，在體外成功地獲得肝臟樣細胞。因此DE的誘導(dǎo)分化具有重要的作用，它是消化系統(tǒng)器官再生、移植研究的基礎(chǔ)。Nodal/activin A 信號在維持干細胞的穩(wěn)定增殖與胚胎的發(fā)育中起著關(guān)鍵的作用[4-5]。Activin A 作為TGF-β 家族的一員，與TGF-β 共同作用于細胞表面的Nodal 信號通路受體，使Nodal/TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活。細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子SMAD2、 SMAD3被磷酸化后與SMAD4作用，后者轉(zhuǎn)移進入細胞核內(nèi)，啟動下游因子的轉(zhuǎn)錄，促進細胞的增殖或分化[6]。本研究探討激活Nodal信號通路在小鼠ESC向DE分化中的作用，尋找小鼠ESC向DE分化的最佳培養(yǎng)體系，為下一步DE定向誘導(dǎo)分化為消化系統(tǒng)細胞提供盡可能多的種子細胞[7]。

材料和方法

1材料與試劑

DMEM、非必需氨基酸和GlutaMAX(Invitrogen)；胎牛血清(Biochrom)；重組小鼠白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor，LIF;Millipore)； β-巰基乙醇(Gibco)； activin A、Wnt3a 和兔抗小鼠單克隆PE-CXCR4抗體 (R&D)；小鼠抗小鼠單克隆OCT4抗體和兔抗小鼠單克隆CXCR4 抗體 (Abcam)；羊抗兔IgG抗體、兔抗小鼠IgG抗體和兔抗小鼠GAPDH單克隆抗體(CST)；S-P超敏試劑盒和DAB顯色試劑盒(博士德公司)。流式細胞儀為BD產(chǎn)品。

2細胞培養(yǎng)

小鼠ESC名稱為ES-E14TG2a；小鼠品系為129/Ola，購于ATCC。將小鼠ESC在無飼養(yǎng)層細胞中貼壁培養(yǎng)，每天觀察并換液， 2～3 d傳代1次。將1×105個細胞種于6孔培養(yǎng)板中,如制作細胞爬片則將24 mm×24 mm大小的滅菌蓋玻片放置6孔培養(yǎng)板中。放在37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

3DE細胞的誘導(dǎo)

根據(jù)培養(yǎng)基的不同分為3組:胚胎干細胞組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+LIF)、自然分化組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)和activin A組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+50 μg/L activin A),并培養(yǎng)1、3、5、7 d。

4方法

4.1流式細胞術(shù)檢測CXCR4陽性細胞的比例0.25% 胰蛋白酶消化、中和、離心后去上清，用PBS 2 mL液重懸細胞，取1.0×106個細胞至流式管，離心、去上清后，PBS 200 μL重懸細胞，該管為空白對照組，從中取30 μL至另一流式管為實驗組，在避光情況下，按每1.0×106個細胞的劑量加入10 μL PE標記的抗小鼠CXCR4單克隆抗體至實驗組中，室溫孵育20 min，PBS洗1次，再用PBS 200 μL重懸細胞，懸液上機測定。由于本次研究使用的CXCR4抗體為PE標記，選擇488 nm的激光進行測定。觀察在不同培養(yǎng)條件下，第1、3、5、7天 各 組細胞中CXCR4+細胞的表達情況。細胞表面分子的表達分析采用BD流式細胞儀，各象限細胞比例等數(shù)據(jù)記錄采用EXPO32 MultiCOMP v1.1C軟件，數(shù)據(jù)分析采用EXPO32 Analysis v1.2B軟件。

4.2免疫細胞化學(xué)檢測定型內(nèi)胚層標志CXCR4的表達取出培養(yǎng)板，PBS洗3 遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 洗3次，每次3 min，加正常兔血清封閉液室溫封閉20 min，滴加稀釋的CXCR4 I抗(1∶50)，4 ℃過夜。PBS洗3次，每次3 min，加生物素標記兔抗大鼠IgG，37 ℃ 孵育20 min，PBS 洗3次，每次3 min；滴加試劑SABC，37 ℃孵育20 min，PBS洗4次，每次5 min。使用DAB顯色試劑盒顯色，蒸餾水洗滌。脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。

4.3Western blot法檢測胚胎干細胞干性標志OCT4及定型內(nèi)胚層標志CXCR4蛋白的表達樣品處理：在6孔板的每個孔中加入配置好的RIPA-cocktail混合液50 μL(冰上操作)，裂解30 min；4 ℃、14 000 r/min、20 min 離心處理后收集上清即得總蛋白質(zhì)樣品。取定量裂解后的細胞樣品100 μL 加入5×蛋白上樣緩沖液25 μL，混勻后放在PCR儀上進行98 ℃、15 min使蛋白變性。按照每孔25 μg 蛋白量上樣，經(jīng)SDS-PAGE 后，將蛋白從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上；加入5 %脫脂奶粉封閉1 h，用TBST 洗膜3次，每次5 min；然后加OCT4及CXCR4的I抗(1∶1 000)，4 ℃搖床慢搖孵育過夜；TBST 緩沖液洗3次，每次5 min，加入II抗(1∶1 000)室溫孵育1 h；TBST 緩沖液洗3次，每次10 min，用化學(xué)發(fā)光劑顯影，X 線片曝光。膠片掃描為電子圖片后，以β-actin作為內(nèi)參照，進行各目的條帶灰度的半定量分析，條帶的灰度分析采用ImageJ軟件。實驗重復(fù)3次。

5統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件，計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間的比較采用單因素方差分析后，各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗進行。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1流式細胞術(shù)檢測結(jié)果

藍色峰代表對照組，紅色峰代表實驗組，紅色峰右移部分即紫色線表示的部分為CXCR4陽性細胞。在培養(yǎng)第1、3、5和7天，胚胎干細胞組所占比例分別為0.353%±0.050%、0.450%±0.100%、0.673%±0.220% 和0.553%±0.100%；自然分化組為分別1.655%±0.023%、4.207%±2.032%、14.993%±3.000%和5.340%±1.525%； 而activin A組分別為4.310%±1.536%、 6.173%±2.022%、31.860%±3.010%和6.557%±2.502%；同一時點不同組進行兩兩比較，自然分化組及activin A組CXCR4陽性細胞比例均高于胚胎干細胞組(P<0.05)，其中在第5天，activin A組CXCR4陽性細胞的比例最高，自然分化組次之。同組不同時點進行兩兩比較，胚胎干細胞組各時點CXCR4陽性細胞的比例無顯著差異；自然分化組及activin A組CXCR4陽性細胞的比例均在第5天達高峰(P<0.05)，見圖1、2。

Figure 1.The proportion of CXCR4+cells.

圖1CXCR4+細胞的比例

Figure 2.The proportion of CXCR4+cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs1 d;#P<0.05vsESC group.

圖2CXCR4陽性細胞所占比例的柱狀圖

2細胞免疫化學(xué)檢測結(jié)果

顯微鏡下觀察CXCR4陽性細胞顯示棕黃色或者棕褐色，見圖3。

3Western blot檢測細胞OCT4及CXCR4蛋白的表達

同組不同時點進行兩兩比較，胚胎干細胞組隨培養(yǎng)時間的延長，OCT4及CXCR4蛋白的表達基本不變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；自然分化組及activin A組隨分化時間的延長，OCT4蛋白的表達逐步下降，CXCR4蛋白的表達逐步增高，與第1天比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在分化第5天進行3組間兩兩比較， activin A組的CXCR4蛋白表達最高，OCT4蛋白表達最低，自然分化組次之，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4及表1、2。

Figure 3.The protein expression of CXCR4. The brown or tan staining observed in the cells was considered as positive CXCR4.Scale bar=50 μm.

圖3ACXCR4蛋白的表達

Figure 4.The expression of OCT4 and CXCR4 detected by Western blot.

圖4OCT4及CXCR4蛋白表達的Western blot條帶分析

表1　OCT4和CXCR4的蛋白條帶灰度比值

*P<0.05vsday 1.

表2第5天OCT4和CXCR4的蛋白條帶灰度比值

Table 2.The ratio of gray of OCT4 and CXCR4 protein bands on day 5 (Mean±SD.n=3)

GroupOCT4CXCR5ESC1.494±0.1560.218±0.038Naturaldifterentia-tion1.051±0.1200.734±0.088*ActivinA0.356±0.045*#1.276±0.230*#

討論

ESC 是一種具有強大的多向分化潛能及自我更新能力的多能干細胞，在體內(nèi)或體外可以分化為成體幾乎所有類型的組織細胞。利用ESC 來源的細胞對機體組織進行修復(fù)及功能替代治療，將可能是未來臨床上治療某些不可逆性疾病(如：心功能不全、遺傳性疾病、糖尿病、神經(jīng)元退變及腸上皮難治性損傷等)的新選擇[8-10]。然而，ESC 誘導(dǎo)分化的細胞數(shù)量有限，不能滿足臨床治療疾病的要求，是目前面臨的重要問題，優(yōu)化ESC的定向誘導(dǎo)培養(yǎng)具有重要的意義。

目前較為公認的小鼠定型內(nèi)胚層標志分子主要有 CXCR4、Sox17、E-cadherin、Tm4sf2和Goose-coid[11-14]。其中，CXCR4 及E-cadherin分別作為趨化因子受體及細胞間連接分子均表達于細胞表面，通過相應(yīng)的抗體，可以使用流式細胞儀進行測定。尤其是CXCR4，在ESC 分化早期僅表達于定型內(nèi)胚層，具有較高的特異性。本研究以CXCR4作為標志分子，對ESC來源的DE的分化進行鑒定。在早期的建系中，ESC以小鼠成纖維細胞為滋養(yǎng)細胞，抑制小鼠ESC的分化。但由于飼養(yǎng)層制備繁瑣，分泌成分不明，給研究帶來諸多不便。后來研究發(fā)現(xiàn)，LIF受體存在于小鼠ESC表面，成纖維細胞通過LIF抑制小鼠ESC的分化。因此ESC在添加一定濃度的LIF培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即使無滋養(yǎng)層細胞亦可以抑制其分化，使其保持多向分化潛能[15-16]。我們的研究發(fā)現(xiàn)， 自然分化組的培養(yǎng)基中去除LIF后，隨著培養(yǎng)時間的延長，DE(CXCR4陽性細胞)的比例、CXCR4蛋白的表達逐步增高，在分化第5天達高峰；干性標志OCT4蛋白的表達逐步下降，提示胚胎干細胞出現(xiàn)了自然分化。既往對模型動物的研究結(jié)果表明，Nodal/activin A 信號是內(nèi)胚層發(fā)育早期最關(guān)鍵的信號系統(tǒng)[17]。多個研究報道顯示，雖然在ESC 體外形成EB 的自然分化過程中可以形成一定比例的DE，但在EB 分化早期(分化后24 h 內(nèi))加入Nodal 通路活化因子activin A可以在一定程度上增加DE的分化比例[18]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，activin A 組加入activin A(50 μg/L)激活Nodal/activin A 信號通路誘導(dǎo)ESC向限定型內(nèi)胚層的分化，結(jié)果顯示DE(CXCR4陽性細胞)的比例和CXCR4蛋白的表達較ESC組和自然分化組明顯增高，在分化第5天達高峰；OCT4蛋白的表達明顯下降，提示激活Nodal/activin A 信號通路可以誘導(dǎo)ESC向DE的分化。這一研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果相似，但以往的研究認為高濃度的activin A(100 μg/L)才能起到這個作用[19]。我們的研究發(fā)現(xiàn), 在小鼠ESC分化早期，采用activin A(50 μg/L)上調(diào)Nodal信號通路，同樣可以促進DE的分化，建立最佳的培養(yǎng)分化體系。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠ESC分化過程中，在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第5天, DE的比例最高。激活Nodal信號通路可以促進小鼠ESC向DE分化，有利于優(yōu)化ESC的定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲取更多的DE細胞，為ESC向消化系統(tǒng)分化提供基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)