申慶民 李文雄 趙松 鄭悅 辛欣 黃立鋒

嚴(yán)重膿毒癥(severe sepsis)是創(chuàng)傷、燒傷、休克和感染等危重患者的常見(jiàn)并發(fā)癥之一,也是誘發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction, MODS)的重要原因,病死率高達(dá)30%以上[1]。研究顯示,連續(xù)靜脈-靜脈血液濾過(guò)(continuous venous-venous hemofiltration, CVVH)能夠降低嚴(yán)重膿毒癥患者的血清細(xì)胞因子水平,因而有可能改善其臨床狀況[2],本研究擬在此基礎(chǔ)上評(píng)價(jià)CVVH對(duì)早期嚴(yán)重膿毒癥患者細(xì)胞免疫功能及臨床評(píng)分的影響。

資料與方法

一、一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲；(2)診斷為嚴(yán)重膿毒癥≤48 h；膿毒癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者存在明確感染或可疑感染,具有感染的全身性表現(xiàn)。嚴(yán)重膿毒癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)：罹患膿毒癥并伴有膿毒癥誘導(dǎo)的器官功能障礙或組織低灌注,包括乳酸酸中毒、少尿或急性意識(shí)狀態(tài)改變等[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠期婦女；(2)慢性終末期疾??；(3)預(yù)期在下一個(gè)48 h內(nèi)死亡的臨終狀態(tài)患者；(4)放棄治療者；(5)不同意簽署知情同意書(shū)者。共納入2013年1月至2016年1月,本院外科ICU(SICU)連續(xù)收治的78例早期嚴(yán)重膿毒癥患者,其中男性41例,女性37例,年齡27～75歲,平均年齡為54.4±5.6歲?；颊咴l(fā)病包括：嚴(yán)重肺部感染25例,多發(fā)傷16例,腹部大手術(shù)后合并嚴(yán)重腹腔感染14例,急性重癥胰腺炎12例,肝移植術(shù)后肝功能延遲恢復(fù)9例,產(chǎn)后羊水栓塞合并大出血2例。合并2個(gè)臟器功能障礙或衰竭33例,3個(gè)臟器功能障礙或衰竭31例,4個(gè)臟器功能障礙或衰竭9例,5個(gè)臟器功能障礙或衰竭5例。55例患者需用血管收縮藥物維持血壓。78例患者依據(jù)適應(yīng)證、禁忌癥及家屬知情選擇的不同,分為常規(guī)治療組32例和CVVH組46例。兩組患者在年齡、性別、病種及病情危重程度等方面比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意,并簽署患者知情同意書(shū)后進(jìn)行。

二、方法

1.一般治療：兩組患者均依據(jù)《拯救膿毒癥運(yùn)動(dòng)(SSC)2012指南更新》[4]進(jìn)行常規(guī)治療,CVVH 組加用CVVH 治療。

2.CVVH 治療方案：所有患者均在診斷為嚴(yán)重膿毒癥的48 h內(nèi)接受 CVVH 治療,經(jīng)右側(cè)頸內(nèi)靜脈或股靜脈置管建立血管通路,使用BRAUN Diapact CRRT機(jī),選用Frensius AV600S聚砜膜濾器,血流量200～250 mL/min,超濾率：35 mL·kg-1·h-1,均使用前稀釋法輸注置換液,每24小時(shí)更換濾器,CVVH 持續(xù)時(shí)間≥ 48 h。無(wú)明顯出血傾向者采用普通肝素全身抗凝,濾器前部分活化凝血活酶時(shí)間(APTT)維持在70～100 s。有顯著出血傾向者,CVVH 治療過(guò)程中每小時(shí)采用100 mL 0.9%等滲鹽水沖洗濾器。

3.標(biāo)本采集：分別于開(kāi)始CVVH治療前(0 h)和治療后24 h、48 h抽取患者外周靜脈血10 mL。

4.T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定：在上述時(shí)間點(diǎn)留取靜脈血100 μL,加入含有20 μL CD4、CD8熒光標(biāo)記抗體(購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司),混勻,避光室溫孵育30 min。加入500 μL 紅細(xì)胞裂解液,孵育15 min,0.9%等滲鹽水洗滌1次。離心棄上清,加入500 μL 0.9%等滲鹽水混勻,靜置10～15 min。流式細(xì)胞術(shù)(FACS)測(cè)定CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分比,并記錄CD4+/CD8+比值。

5.血清細(xì)胞因子檢測(cè)：在上述時(shí)間點(diǎn)留取靜脈血5 mL,自然析出上清液(血清),收集標(biāo)本置于-30℃冰箱保存,用于細(xì)胞因子TNF-α、IL-2和IL-4水平檢測(cè)。

6.疾病嚴(yán)重程度評(píng)分：分別于上述時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)并記錄患者的急性生理與慢性健康狀況評(píng)分(APACHE Ⅱ)及序貫性臟器衰竭評(píng)價(jià)評(píng)分(SOFA評(píng)分)變化情況。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組患者治療前后T淋巴細(xì)胞亞群比較

兩組患者在治療前CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和CD4+/CD8+比值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05),治療48 h后,CVVH組患者CD4+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和CD4+/CD8+比值顯著升高,CD8+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著降低,與同組患者治療前及同期常規(guī)治療組患者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示膿毒癥患者的細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)得到改善。常規(guī)治療組患者上述指標(biāo)與CVVH組變化趨勢(shì)相同,但治療前后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

二、兩組患者治療前后血清細(xì)胞因子水平比較

兩組患者治療前TNF-α、IL-2和IL-6表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),治療48 h后,CVVH組患者TNF-α、IL-2和IL-6表達(dá)水平顯著降低,與同組患者治療前及同期常規(guī)治療組患者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。常規(guī)治療組患者上述指標(biāo)與CVVH組變化趨勢(shì)相同,但治療前后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1 常規(guī)治療組和CVVH組治療前后T淋巴細(xì)胞亞群比較

注：與CVVH組0 h比較:aP<0.05；與常規(guī)治療組48 h比較:bP<0.05

表2 常規(guī)治療組和CVVH組患者治療前后血清細(xì)胞因子水平比較

注：與CVVH組0 h比較:aP<0.05；與常規(guī)治療組48 h比較:bP<0.05

三、兩組患者治療前后臨床評(píng)分比較

兩組患者在治療前APACHEⅡ評(píng)分及SOFA評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),治療48 h后,CVVH組患者APACHEⅡ評(píng)分及SOFA評(píng)分顯著降低,與同組患者治療前及同期常規(guī)治療組患者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。常規(guī)治療組患者上述指標(biāo)與CVVH組變化趨勢(shì)相同,但治療前后比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

討 論

嚴(yán)重膿毒癥的高病死率與機(jī)體免疫細(xì)胞低反應(yīng)狀態(tài)相關(guān),免疫功能紊亂可能影響疾病的發(fā)展和其他治療的療效,直接影響膿毒癥患者的預(yù)后[5]。嚴(yán)重膿毒癥患者單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量因過(guò)度抑制而處于低限,表現(xiàn)為單核細(xì)胞呈遞抗原功能減弱、抗原特異性T、B淋巴細(xì)胞凋亡的免疫麻痹狀態(tài)[6]。T細(xì)胞表面的CD分子不僅是T細(xì)胞分化的產(chǎn)物,也是T細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)功能的分子基礎(chǔ),T淋巴細(xì)胞亞群的變化反映了人體細(xì)胞免疫機(jī)能的改變[7]。CD4+細(xì)胞代表輔助性T淋巴細(xì)胞(Th),CD8+細(xì)胞代表抑制性T淋巴細(xì)胞。正常情況下,CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)平衡及相互反饋調(diào)節(jié)狀態(tài),CD4+/CD8+比值可反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài),CD4+/CD8+比值降低反映細(xì)胞免疫功能處于抑制狀態(tài)[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn),早期嚴(yán)重膿毒癥患者在CVVH治療前其T淋巴細(xì)胞亞群分布處于抑制狀態(tài),經(jīng)CVVH 治療48 h后,其CD4+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、CD4+/CD8+比值較治療前和常規(guī)治療組均有不同程度的升高,而CD8+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)有所下降。提示CVVH可能通過(guò)降低血清細(xì)胞因子水平,減少了細(xì)胞因子對(duì)淋巴單核細(xì)胞的再刺激,使炎癥介質(zhì)分泌減少,避免了炎癥介質(zhì)的級(jí)聯(lián)效應(yīng),使處于抑制狀態(tài)的單核細(xì)胞得以逐漸恢復(fù),顯著改善了單核細(xì)胞的分泌功能,調(diào)節(jié)其過(guò)度活躍或過(guò)度抑制狀態(tài),調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群,因而可明顯改善嚴(yán)重膿毒癥患者已下調(diào)的T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和比例,進(jìn)而改善其免疫抑制狀態(tài),重建患者機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

表3 常規(guī)治療組和CVVH組患者治療前后臨床評(píng)分比較

注：與CVVH組0 h比較:aP<0.05；與常規(guī)治療組48 h比較:bP<0.05

T淋巴細(xì)胞識(shí)別經(jīng)由抗原提呈細(xì)胞提呈的抗原而活化,其中CD4細(xì)胞激活后分化成兩種輔助T淋巴細(xì)胞亞群即Thl、Th2,釋放的細(xì)胞因子發(fā)揮免疫功能。Thl、Th2型細(xì)胞因子具有對(duì)抗性,Thl釋放TNF-α、IL-2、IFN-γ等促炎因子；Th2釋放IL-4、IL-10等抗炎因子。CD4+T淋巴細(xì)胞分化的偏移是導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生后機(jī)體免疫狀態(tài)從亢進(jìn)到抑制轉(zhuǎn)變的重要因素。探討T淋巴細(xì)胞具有免疫功能的細(xì)胞因子的變化情況,可為恢復(fù)感染后抗炎/促炎的平衡提供新的調(diào)控手段。本研究結(jié)果顯示,與治療前及常規(guī)治療組比較,CVVH治療后48 h血清TNF-α、IL-2及IL-6等細(xì)胞因子顯著下降。究其原因,CVVH濾器膜孔徑可允許分子量為30 000～50 000道爾頓的溶質(zhì)被濾出,多數(shù)中小分子物質(zhì)包括各種活化的補(bǔ)體成分、趨化因子、小肽和血管源性物質(zhì),以及尿素氮、肌酐、胍類(lèi)等可經(jīng)CVVH濾過(guò)；濾器還可以吸附部分炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子[10]；CVVH可以非選擇性地清除血清促炎與抗炎細(xì)胞因子,降低血清細(xì)胞因子“峰”濃度,非特異地下調(diào)全身炎性反應(yīng),低一級(jí)水平的促炎和抗炎介質(zhì)又可為機(jī)體免疫自穩(wěn)狀態(tài)的恢復(fù)提供條件,因而有可能降低免疫紊亂對(duì)器官功能的損傷程度[11]。

本研究還發(fā)現(xiàn),早期嚴(yán)重膿毒癥患者經(jīng)過(guò)CVVH治療后,APACHE II評(píng)分和SOFA評(píng)分均較治療前及常規(guī)治療組顯著降低,提示早期CVVH能夠改善患者的器官功能和臨床狀況。這與其能夠選擇性地清除炎癥介質(zhì)、恢復(fù)免疫平衡、改善癥狀、穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)、逆轉(zhuǎn)器官的損傷緊密相關(guān)。由于本組樣本例數(shù)尚少,存在一定的局限性,尚需進(jìn)一步的大樣本研究,從而為膿毒癥的預(yù)防與治療提供新思路。

1 黃立鋒,姚詠明,董寧,等．血漿凝溶膠蛋白水平對(duì)嚴(yán)重?zé)齻摱景Y患者預(yù)后的意義[J] ．中華燒傷雜志,2016,32(2)：77-81.

2 Iwagami M,Yasunaga H,Noiri E,et al. Potential Survival Benefit of Polymyxin B Hemoperfusion in Septic Shock Patients on Continuous Renal Replacement Therapy: A Propensity-Matched Analysis[J]. Blood Purif,2016,42(1)：9-17.

3 Angus DC,van der Poll T. Severe sepsis and septic shock[J]. N Engl J Med,2013,369(9)：840-851.

4 黃順偉,管向東．拯救膿毒癥運(yùn)動(dòng)(SSC)2012 指南更新概要[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社,2013:79-88.

5 Huang LF,Yao YM, Sheng ZY. Novel insights for high mobility group box 1 protein-mediated cellular immune response in sepsis: A systemic review[J]. World J Emerg Med,2012,3(3)：165-171.

6 Shao R,Li CS,Fang Y,et al. Low B and T lymphocyte attenuator expression on CD4(+) T cells in the early stage of sepsis is associated with the severity and mortality of septic patients: a prospective cohort study[J]. Crit Care,2015,19：308.

7 Darcy CJ,Minigo G,Piera KA,et al. Neutrophils with myeloid derived suppressor function deplete arginine and constrain T cell function in septic shock patients[J]. Crit Care,2014,18(4)：163.

8 黃立鋒,姚詠明,張立天,等．嚴(yán)重?zé)齻笳{(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫活性變化及其與患者預(yù)后的關(guān)系[J]. 中華創(chuàng)傷雜志,2010,26(9)： 785-789.

9 Markwart R,Condotta SA,Requardt RP,et al. Immunosuppression after sepsis: systemic inflammation and sepsis induce a loss of na?ve T-cells but no enduring cell-autonomous defects in T-cell function[J]. PLoS One,2014,9(12)：e115094.

10 Dabrowski W,Kotlinska-Hasiec E,Schneditz D,et al. Continuous veno-venous hemofiltration to adjust fluid volume excess in septic shock patients reduces intra-abdominal pressure[J]. Clin Nephrol,2014,82(1)：41-50.

11 Dabrowski W,Kocki T,Pilat J,et al. Changes in plasma kynurenic acid concentration in septic shock patients undergoing continuous veno-venous haemofiltration[J]. Inflammation,2014,37(1)：223-234.