孟志強(qiáng)　郭斌　吳若丹　白云鶴　周三國(guó)

【摘要】 目的 通過(guò)對(duì)比分析熱休克蛋白（HSP27）表達(dá)的變化并探討甲基強(qiáng)的松龍（MP）在預(yù)防脊髓缺血再灌注損傷脊髓中的最佳用藥時(shí)間。方法 30只 SD大鼠， 分為甲、乙、丙、丁、戊組， 每組6只。甲組暴露腹主動(dòng)脈， 無(wú)其他治療；乙、丙、丁、戊組關(guān)閉30 min主動(dòng)脈造成脊髓缺血再灌注損傷， 乙組在損傷前30 min尾靜脈注射生理鹽水， 丙、丁、戊組分別與損傷前30、60、180 min尾靜脈注射生理30 mg/kg的MP。甲組于術(shù)后、其他組于損傷后180 min行免疫組化染色檢測(cè)， 觀察對(duì)比各組HSP27的相對(duì)含量。結(jié)果 HSP27相對(duì)含量比較， 乙組和戊組比較， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；丙組和丁組比較， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；丙組和丁組的HSP27表達(dá)強(qiáng)于乙組和戊組， 比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 在脊髓缺血再灌注損傷前30 min應(yīng)用MP， 可減輕脊髓缺血再灌注損傷， 提升HSP27的表達(dá)強(qiáng)度， 具有極高的應(yīng)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 熱休克蛋白；大鼠脊髓缺血再灌注損傷脊髓；甲基強(qiáng)的松龍

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.01.214

脊髓缺血再灌注損傷指的是脊髓功能沒(méi)有在去除脊髓缺血因素后恢復(fù)正常， 嚴(yán)重情況下脊髓神經(jīng)元發(fā)生不可逆的遲發(fā)性死亡。作為一種保護(hù)性蛋白， HSP27具有廣泛且關(guān)鍵的作用， 能增強(qiáng)細(xì)胞在不利環(huán)境下的適應(yīng)能力。相關(guān)的研究證實(shí)[1]， MP可增強(qiáng)急性脊髓損傷局部脊髓組織中的HSP27表達(dá)， 但其脊髓缺血再灌注損傷局部脊髓組織中HSP27表達(dá)的影響研究較少。本研究旨在通過(guò)對(duì)比分析HSP27表達(dá)的變化并探討MP在預(yù)防脊髓缺血再灌注損傷脊髓中的最佳用藥時(shí)間[2， 3]?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 選用由某動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的30只純種SD大鼠作為研究對(duì)象， 均為雄性， 4月齡， 平均體重（252±18）g。隨機(jī)將其分為甲、乙、丙、丁、戊組， 每組6只。甲組暴露腹主動(dòng)脈， 無(wú)其他治療；乙、丙、丁、戊組關(guān)閉30 min主動(dòng)脈造成脊髓缺血再灌注損傷， 乙組在損傷前30 min尾靜脈注射生理鹽水， 丙、丁、戊組分別與損傷前30、60、180 min尾靜脈注射生理30 mg/kg的MP。

1. 2 動(dòng)物模型制作及標(biāo)本制備 脊髓缺血再灌注損傷動(dòng)物模型通過(guò)關(guān)閉主動(dòng)脈的方式建立[4， 5]， 腹腔麻醉以6 ml/kg注射7%水合氯醛完成。按照無(wú)菌操作打開腹腔， 暴露主動(dòng)脈， 于右腎動(dòng)脈分支下、左腎動(dòng)脈分支， 夾閉腹主動(dòng)脈， 停止血流， 維持30 min。甲組大鼠于術(shù)后、其他組大鼠于缺血再灌注后180 min處死大鼠， 取圓錐上l cm處的脊髓做常規(guī)石蠟橫切片， 每個(gè)標(biāo)本4張， 3張備用， 1張行免疫組化染色檢測(cè)。

1. 3 組織學(xué)檢查 每只大鼠取1張切片行免疫組化染色， 采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量， 400倍光鏡下6個(gè)不同視野中的染色陽(yáng)性物質(zhì)的吸光度A， 以吸光度表示HSP27的相對(duì)含量。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；免疫組化陽(yáng)性物質(zhì)吸光度A， 用LSD分析組間差異。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

組間吸光度值差異用LSD分析， 乙組和戊組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 丙組和丁組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 且丙組和丁組的HSP27表達(dá)強(qiáng)于乙組和戊組， 比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

有多種途徑和因素可導(dǎo)致脊髓缺血再灌注損傷， 歸納包括：①細(xì)胞內(nèi)Ca2+在興奮性氨基酸的誘導(dǎo)下大量堆積， 引發(fā)介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡；②細(xì)胞膜的組成成分（酶、RNA、DNA）與細(xì)胞內(nèi)形成的氧自由基共價(jià)結(jié)合， 引發(fā)細(xì)胞膜功能和結(jié)構(gòu)的變化；③白細(xì)胞在白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-8以及細(xì)胞間黏附分子-1水平升高的情況下， 其不斷聚集并相互粘附， 引發(fā)炎癥。臨床上尚無(wú)治療脊髓缺血再灌注損傷的特效藥， MP、地塞米松可在損傷早期有效減輕炎癥反應(yīng)。近年來(lái)， 不斷有治療脊髓缺血再灌注損傷的新藥， 比如強(qiáng)力霉素、右羥嗎喃、尼莫地平、放線菌酮環(huán)己酰亞胺等， 盡管在促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)上有所療效， 但其他療效并不明顯， 有待進(jìn)一步研究。而MP的應(yīng)用較為廣泛， 其療效明顯， 其抗炎作用是氫化可的松的4倍、鹽皮質(zhì)激素的5倍。MP是一種合成糖皮質(zhì)激素， 不僅能抗氧化、抗炎， 還能減少興奮性氨基酸的釋放和細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平， 在脊髓缺血再灌注損傷的臨床治療中具有廣泛的應(yīng)用， 但學(xué)界對(duì)MP在預(yù)防脊髓缺血再灌注損傷的作用研究尚少。

HSP27是一種小分子熱休克蛋白， 能保護(hù)細(xì)胞， 增強(qiáng)細(xì)胞的適應(yīng)力， 可用染色陽(yáng)性物質(zhì)的吸光度A表示其表達(dá)強(qiáng)度， 學(xué)界通常以HSP27的表達(dá)強(qiáng)度來(lái)量化MP的療效。在本次研究中， HSP27表達(dá)強(qiáng)度比較， 乙組和戊組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 丙組和丁組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 且丙組和丁組的HSP27表達(dá)強(qiáng)于乙組和戊組， 比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

綜上所述， 在脊髓缺血再灌注損傷前30 min應(yīng)用MP， 可減輕脊髓缺血再灌注損傷， 提升HSP27的表達(dá)強(qiáng)度， 具有極高的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1] 齊兵獻(xiàn).參附注射液對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷NF-κBp65和IκB-α影響的實(shí)驗(yàn)研究.甘肅中醫(yī)學(xué)院， 2012.

[2] 周若南.甲基強(qiáng)的松龍上調(diào)缺血再灌注損傷脊髓熱休克蛋白27表達(dá)的劑量研究.鄭州大學(xué)， 2010.

[3] 張子峰， 白玉樹， 侯鐵勝， 等.甲基強(qiáng)的松龍與鈣蛋白酶抑制劑對(duì)大鼠缺血再灌注損傷脊髓保護(hù)作用比較.中國(guó)矯形外科雜志， 2011， 19（12）：1026-1029.

[4] 孟志強(qiáng).甲潑尼松龍預(yù)干預(yù)脊髓缺血再灌注損傷對(duì)Caspase-3表達(dá)的影響.鄭州大學(xué)， 2011.

[5] 王文剛， 夏磊， 劉國(guó)強(qiáng)， 等.早期應(yīng)用甲基強(qiáng)的松龍上調(diào)受損脊髓細(xì)胞內(nèi)hsp27蛋白的表達(dá)醫(yī)藥論壇雜志， 2007， 28（3）：6-8.

[收稿日期：2015-07-17]