新生兒窒息后血清對(duì)人腎近曲小管上皮細(xì)胞線粒體膜通透性的影響*

趙婧1董文斌1李鵬云3王明勇2鄧存良2許開(kāi)桂1

(四川醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1.新生兒科,2.傳染與免疫研究室, 3.四川醫(yī)科大學(xué)心肌電生理學(xué)研究室, 四川 瀘州 64600)

【摘要】目的研究新生兒窒息后血清對(duì)人腎近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)線粒體膜通透性的影響。方法以人腎近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)共分為: 正常對(duì)照組、窒息組和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)干預(yù)組。以20%窒息后24小時(shí)血清作為攻擊濃度。用四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(JC-1)檢測(cè)HK-2細(xì)胞線粒體膜電位變化；Western blot測(cè)HK-2細(xì)胞內(nèi)線粒體中CytC的釋放情況。結(jié)果①經(jīng)窒息血清攻擊后HK-2細(xì)胞線粒體膜紅/綠熒光強(qiáng)度比值(590/530nm)明顯降低(P<0.01)，但有了PDTC干預(yù)，HK-2細(xì)胞線粒體膜紅/綠熒光強(qiáng)度比值明顯升高(P<0.01)。②正常組HK-2細(xì)胞的胞漿中不含細(xì)胞色素C，主要存在于線粒體內(nèi)，窒息組胞漿中細(xì)胞色素C從線粒體漏出較對(duì)照組明顯增加，相應(yīng)的在線粒體內(nèi)表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PDTC干預(yù)組胞漿中細(xì)胞色素C表達(dá)也有所增加，但大部分仍位于線粒體內(nèi)，與窒息組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論新生兒窒息后血清可影響人HK-2細(xì)胞線粒體膜通透性，使線粒體膜電位下降，膜間隙蛋白如細(xì)胞色素C等漏出。其胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制涉及到NF-κB活化。

【關(guān)鍵詞】嬰兒； 新生； 窒息； 凋亡； 線粒體； 核因子-κB；腎損傷

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 722.12【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

基金項(xiàng)目：四川省杰出青年學(xué)科帶頭人培養(yǎng)基金(04ZQ026-033);四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(2008JY0015)

通訊作者：董文斌，教授，E-mail: dongwenbin2000@163.com

收稿日期：( 2015-01-19； 編輯： 張文秀)

Effect of postasphyxial-serum in neonate on the mitochondria membrane permeability in renal tubular cellsZHAO Jing1,DONG Wenbin1,LI Pengyun2,etal

(1.DepartmentofNewbornMedicine，Luzhou646000,Sichuan,China; 2.LaboratoryofInfectionandImmunity,

TheAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege，Luzhou646000,Sichuan,China; 3.InstituteofMyocardium

Electrophysiology,SichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,Sichuan,China)

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of postasphyxial-serum in neonate on the mitochondria membrane permeability in renal tubular cells. MethodsHuman renal proximal tubular cell line HK-2 cell was used as target cell, which was divided into control group, asphyxia group and pyrrolodine dithiocarbamate (PDTC) blocking group. The attacking concentration of serum was 20%. The mitochondria membrane potential was detected by 5,5,6,6 -tetrachloro-1,1,3,3 -tetraethyl benzimidazolyl carbocyanine iodide(JC-1), and the release of the apoptogenic mitochondrial proteins cytochrome C was assessed by Western Blot.ResultsThe red/green fluorescence light intensity ratio of mitochondria membrane potential(590/530nm) in asphyxia group and PDTC blocking group were significantly lower than that in normal control group(P<0.01). The red/green fluorescence light intensity ratio of mitochondria membrane potential(590/530nm)in PDTC blocking group was significantly increased(P<0.01) compared with that of other groups. Cytochrome C was not present in the cytosolic fraction of normal cells. Increasing amounts of cytochrome C were detected in the cytosol of postasphyxial-serum treated cells, with a concomitant decrease of cytochrome C in the mitochondrial fraction(P<0.05). In contrast, no significant release of cytochrome C into the cytosol or change in the amount of cytochrome C in the mitochondrial fraction was detected in PDTC-treated cells(P<0.05).ConclusionThese data demonstrates that postasphyxial-serum is a stimulus, which can decrease the mitochondria membrane potential in human renal tubular cells and along with the release of cytochrome C from mitochondria to cytosol. It's intracellular signal transduction mechanism is presumably involved in the activation of nuclear factor-κB (NF-κB).

【Key words】Infant, Neonate; Asphyxia; Apoptosis; Mitochondria; Nuclear factor-κB; Renal injury

新生兒窒息可以導(dǎo)致多器官功能的損傷，腎損傷的發(fā)病率最高，其中腎小管又是腎損傷發(fā)生最早的部位[1]，而凋亡作為其損傷的一種形式已得到證實(shí)[2,3]。線粒體作為真核細(xì)胞內(nèi)的"能量工廠"，其狀態(tài)決定細(xì)胞死亡的類(lèi)型。不同凋亡途徑都是通過(guò)作用于線粒體膜來(lái)決定凋亡是否發(fā)生。線粒體膜電位的下降被認(rèn)為是凋亡的早期事件[4]。線粒體膜通透性發(fā)生改變后還可能使膜間隙中的凋亡蛋白釋放，細(xì)胞進(jìn)入不可逆凋亡過(guò)程。但在窒息后腎小管損傷中是否發(fā)生線粒體膜通透性的改變及其發(fā)生機(jī)制如何，尚不明確。因此，本研究以人近曲腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)為研究對(duì)象，探討新生兒窒息后血清對(duì)HK-2細(xì)胞線粒體膜電位的影響及膜間隙蛋白釋放情況，旨在探索窒息后腎細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制，為探索新的防治方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料及試劑人HK-2引自ATCC(American Type Culture Collection);DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)；胰酶(美國(guó)sigma公司)；胎牛血清(成都雅信科技公司)；吡咯烷二硫氨基甲酸-PDTC(美國(guó)sigma公司)；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(Biovision)；兔抗人cytochrome C多克隆抗體(美國(guó)CST公司)。其余試劑均為市售分析純。

1.2新生兒窒息后血清的制備[2]選擇2007年1～4月在我科住院的足月重度室息新生兒，且均未使用免疫抑制制劑、無(wú)明顯感染性疾病。在窒息后24h抽取外周血5 mL(肝素抗凝)，2500 r/min離心10min，分離血清，56℃ 水浴30 min滅活補(bǔ)體，微孔濾器過(guò)濾除菌，采用DMEM培養(yǎng)液配成20%(體積比，v/v)的攻擊濃度待用。

1.3實(shí)驗(yàn)分組用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、窒息組和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)干預(yù)組。先在六孔板內(nèi)平放消毒蓋玻片(20mm×20mm),根據(jù)分組，將已生長(zhǎng)至約80%匯合的細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中消化成單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按每孔80000個(gè)細(xì)胞接種在蓋玻片上，加培養(yǎng)液至2ml。待細(xì)胞完全貼壁后，均于實(shí)驗(yàn)前12小時(shí)換液使細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖同步，于37℃，5%CO2條件下進(jìn)行如下處理：①窒息組:每組培養(yǎng)液換成含20%窒息后血清的DMEM培養(yǎng)液。②PDTC干預(yù)組:每組培養(yǎng)液換成含20%窒息血清的DMEM培養(yǎng)液后，同時(shí)加40 μmol/L PDTC。③正常對(duì)照組:每組培養(yǎng)液換成不含窒息血清的DMEM 培養(yǎng)液，上述培養(yǎng)體系其余培養(yǎng)條件完全一致，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h后，觀察損傷指標(biāo)。

1.4檢測(cè)線粒體膜電位(△ψm)的變化待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液換成含終濃度為0.5μM JC-l DMEM培養(yǎng)基，37℃ 、5%CO2避光孵育20min，再用1ml預(yù)熱的緩沖液漂洗一次。置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為 488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530nm及590nm分別觀察綠色和紅色熒光。計(jì)算機(jī)采集圖像熒光值，計(jì)算紅/綠熒光強(qiáng)度比值。

1.5凋亡蛋白-CytC的釋放用胰酶細(xì)胞消化液(Trypsin-EDTA Solution)消化細(xì)胞后離心收集細(xì)胞(4×107個(gè))，用臨用前添加了1mM PMSF的線粒體分離試劑輕輕重懸細(xì)胞沉淀，冰浴放置10～15 min。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到2ml的玻璃勻漿器中，勻漿40下(臺(tái)盼藍(lán)染色，鑒定勻漿效果)。把細(xì)胞勻漿在 600g，4℃離心10 min。轉(zhuǎn)移上清到另一1.5ml離心管中，在11,000g，4℃離心10min。吸取上清并儲(chǔ)存在-80℃下(胞漿部分)；余下的沉淀用臨用前添加了1mM PMSF的線粒體裂解液裂解，裂解后的樣品即為線粒體蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50μg蛋白用于Western blot試驗(yàn)：10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，BSA37℃封閉1h，加入一抗，4℃過(guò)夜，漂洗三次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，加入ECL試劑，X線膠片曝光成像。

2結(jié)果

2.1窒息后血清導(dǎo)致HK-2細(xì)胞線粒體膜電位變化情況JC-1是一種能夠滲透到細(xì)胞器內(nèi)并且特異性與細(xì)胞中線粒體結(jié)合的陽(yáng)離子染料，是目前被認(rèn)為檢測(cè)線粒體膜電位最好的熒光染劑。在線粒體膜電位低時(shí)以單體存在，呈綠色熒光(530nm)；而在正常細(xì)胞JC-1以多聚體形式存在，發(fā)出明亮的紅色熒光(590nm)。各組HK-2 細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位在不同波長(zhǎng)熒光激發(fā)下強(qiáng)度變化見(jiàn)圖1?？梢钥闯觯?90nm發(fā)散波長(zhǎng)下，JC-1在對(duì)照組HK-2細(xì)胞中以多聚體形式存在于線粒體內(nèi)，發(fā)出明亮的紅色熒光，有少量以單體形式存在于胞質(zhì)內(nèi)，在530nm發(fā)散波長(zhǎng)下發(fā)出淺綠色熒光，兩張圖片疊加后呈現(xiàn)橙色熒光；窒息組HK-2細(xì)胞紅色熒光明顯變淡，說(shuō)明線粒體膜電位被去極化，JC-1不能在線粒體內(nèi)聚集，而在胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)亮綠色熒光，兩張圖片疊加后呈現(xiàn)黃綠色熒光；JC-1能在PDTC干預(yù)組HK-2細(xì)胞線粒體內(nèi)聚集，并發(fā)出紅色熒光，少部分存在于胞質(zhì)內(nèi)，發(fā)出綠色熒光，兩張圖片疊加后呈現(xiàn)黃色熒光。

可以根據(jù)紅/綠熒光強(qiáng)度比值來(lái)標(biāo)志線粒體膜電位的喪失[5,6]。應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡半定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體JC-1熒光強(qiáng)度顯示,窒息組和PDTC干預(yù)組細(xì)胞線粒體膜紅/綠熒光強(qiáng)度比值組(590/530nm)明顯低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。但與窒息組相比，PDTC干預(yù)組細(xì)胞線粒體膜紅/綠熒光強(qiáng)度比值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

Table 1　JC-1 fluorescence ratios

注：F=68.558。①與對(duì)照組比較，P值為0.000；②與窒息組比較，P值為0.000。

2.2窒息后血清誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C胞漿轉(zhuǎn)位目的條帶位于分子量14KDa處，用Quantity One分析軟件進(jìn)行光密度(optical density，OD)分析。對(duì)照組HK-2細(xì)胞的胞漿中不含細(xì)胞色素C，主要存在于線粒體內(nèi)；窒息組細(xì)胞胞漿中細(xì)胞色素C從線粒體漏出較對(duì)照組明顯增加，相應(yīng)的在線粒體內(nèi)表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PDTC干預(yù)組胞漿中細(xì)胞色素C表達(dá)也有所增加，但大部分仍位于線粒體內(nèi)，與窒息組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2，圖2。

圖1窒息后血清導(dǎo)致HK-2細(xì)胞線粒體膜電位變化情況 (激光共聚焦顯微鏡×400)

Figure 1　The membrane potential of mitochondria

注：F胞漿/線粒體=16.458；①與對(duì)照組比較，P胞漿/線粒體值為0.011；②與窒息組比較，P胞漿/線粒體值為0.034。

圖2窒息后血清誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C胞漿轉(zhuǎn)位

Figure 2The release of cytochrome C from mitochondria after postasphyxial-serum challenge

注：(a)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C； (b)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C

3討論

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸、電子傳遞、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的重要場(chǎng)所。由于線粒體內(nèi)外兩層單位膜不同的選擇通透性，當(dāng)電子在線粒體內(nèi)膜電子鏈上傳遞的同時(shí)，伴隨H 由基質(zhì)內(nèi)通過(guò)質(zhì)子泵泵出到膜間腔，形成跨線粒體內(nèi)膜電化學(xué)質(zhì)子梯度(△ψm)?！鳓譵對(duì)維持線粒體的正常功能是必要的。在神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷所致的細(xì)胞凋亡中可以觀察到線粒體膜電位(△ψm)的下降[7]，一旦線粒體膜電位完全耗散，細(xì)胞就將進(jìn)入不可逆凋亡過(guò)程，最終引起細(xì)胞死亡。

新生兒窒息復(fù)蘇后的過(guò)程實(shí)際上是缺血再灌注過(guò)程，在此過(guò)程中機(jī)體可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)及大量氧自由基，爆發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)[8,9]，對(duì)窒息發(fā)病及腎損傷的發(fā)生起重要作用。而窒息后腎損傷發(fā)生的高峰在24h內(nèi)[10]，因此本研究采用窒息后1d的血清來(lái)攻擊HK-2細(xì)胞，造成細(xì)胞損傷模型。本研究在前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)凋亡是窒息后腎損傷的一種形式的基礎(chǔ)上[2]，進(jìn)一步研究線粒體膜通透性變化在窒息后腎損傷的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新生兒窒息后血清可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞線粒體膜電位下降，使膜間隙蛋白漏出，證明線粒體的功能紊亂可能參與了窒息后血清所致的細(xì)胞凋亡。

已知NF-κB是一種信號(hào)傳遞分子，作為細(xì)胞內(nèi)具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增生和凋亡中發(fā)揮重要作用[11～13]。也已證實(shí)腎小管細(xì)胞凋亡的機(jī)制牽涉到NF-κB的活化[2]。而本研究在培養(yǎng)體系中加入NF-κB特異性抑制劑PDTC后，可以反轉(zhuǎn)窒息后血清導(dǎo)致的線粒體膜電位下降和阻止細(xì)胞色素C釋放。進(jìn)一步證實(shí)了NF-κB活化參與的窒息后血清誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能通過(guò)作用于線粒體來(lái)介導(dǎo)。其可能的機(jī)制牽涉到線粒體內(nèi)膜非特異性通透性孔道(Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP)的持續(xù)開(kāi)放和Bcl-2蛋白家族的協(xié)同作用[14]。

MPTP是由電位依賴(lài)性陰離子通道(VDAC)、腺甘酸移位酶(ANT)及親環(huán)素D(Cyp-D)復(fù)合物在內(nèi)外膜交界處構(gòu)成的一種復(fù)合結(jié)構(gòu)[15]。MPTP周期性開(kāi)放，以維持線粒體內(nèi)外電化學(xué)平穩(wěn)及穩(wěn)定狀態(tài)。研究表明，許多因素可誘導(dǎo)PT孔開(kāi)放，如促凋亡第二信使Ca 、強(qiáng)氧化劑、NO、神經(jīng)酰胺、炎癥介質(zhì)和caspase等[16]。而在窒息條件下機(jī)體產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)及氧自由基，除了直接參于缺血缺氧性損傷外，這些損傷因子還可能使MPTP持續(xù)性開(kāi)放，形成大的不可逆性的質(zhì)子流[17]；同時(shí)炎癥介質(zhì)還能激活細(xì)胞漿內(nèi)處于無(wú)活性狀態(tài)的NF-κB，使其轉(zhuǎn)位于胞核，進(jìn)一步上調(diào)炎癥應(yīng)答因子，相互形成不斷放大的循環(huán)過(guò)程。激活的NF-κB還能上調(diào)Bcl-2家族促凋亡蛋白的表達(dá)， Bax與VDAC相互協(xié)同作用后有利于MPTP持續(xù)開(kāi)放[18]。這些均使線粒體膜電位下降、耗散，線粒體腫脹，外膜破裂。進(jìn)而膜間隙蛋白細(xì)胞色素C漏出，細(xì)胞色素C一旦進(jìn)入細(xì)胞漿，在ATP或dATP的參與下，與凋亡蛋白水解酶激活因子1(apoptosis protease activation factor-1，Apaf-1)及caspase-9共同組成凋亡體(apoptosome)。激活caspase-9，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)[19]。激活的caspase-9再活化caspase-3，caspase-7，作用于底物蛋白Lamin(核纖層蛋白)、DNA破碎因子、CAD(caspase activated DNAase)多聚腺苷二磷酸核糖聚合物酶(PARP)、ACINUS(apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus)甾體激素反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CRED-1，2)等，繼而引起細(xì)胞核濃縮及DNA裂解，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡?；罨腃aspase還能夠加重線粒體膜電位的耗散，在這些相互聯(lián)系、不斷放大的機(jī)制作用下，將最終導(dǎo)致HK-2細(xì)胞進(jìn)入不可逆凋亡過(guò)程。

4結(jié)論

本研究證實(shí)了凋亡的線粒體途徑參與了窒息后血清誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡。其機(jī)制涉及到線粒體膜通透性改變，提示穩(wěn)定線粒體膜功能，切斷凋亡級(jí)鏈反應(yīng)中的上游環(huán)節(jié)可能會(huì)減輕窒息后腎損傷的發(fā)生。

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