■左颯颯 牛東澤 鄭明利 江 迪 徐春城

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京100083)

根據(jù)農(nóng)業(yè)部種植業(yè)管理司的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國2014年的玉米產(chǎn)量為21 565萬噸[1]，按照玉米籽粒與秸稈1∶1.2的比例推算，2014年我國玉米秸稈的產(chǎn)量為25 878萬噸。玉米秸稈是反芻動(dòng)物重要的粗飼料資源，然而，在我國每年約1/4的秸稈被直接焚燒[2]，既浪費(fèi)資源，又污染環(huán)境。玉米秸稈由于可溶性碳水化合物含量低，木質(zhì)纖維素含量高，消化性差等營養(yǎng)缺陷，導(dǎo)致其飼料利用率較低。因此，通過現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)手段改善玉米秸稈營養(yǎng)價(jià)值、提高秸稈利用效率逐漸成為研究熱點(diǎn)[3-5]。

生物接種劑主要包括微生物制劑和酶制劑。添加微生物制劑的目的是依靠以乳酸菌為主的有益菌，迅速將青綠飼料中的可溶性碳水化合物（WSC）轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸（主要為乳酸），使青貯飼料的pH值迅速下降，抑制其他好氧微生物對(duì)青綠飼料營養(yǎng)成分的分解作用，從而使青綠飼料得以保存[6]。而添加纖維素酶制劑則使飼料中的纖維素在纖維素酶的作用下，部分被酶解轉(zhuǎn)化為WSC，作為乳酸菌（LAB）的發(fā)酵底物[7]，從而提高青貯的發(fā)酵品質(zhì)。青貯飼料開封后，由于好氧細(xì)菌、酵母、霉菌的活動(dòng)，導(dǎo)致飼料發(fā)生好氧變質(zhì)，其主要表現(xiàn)為溫度、pH值上升以及真菌菌斑的出現(xiàn)等[8]。通常情況下，當(dāng)開封后青貯飼料的溫度高于環(huán)境溫度2℃視為變質(zhì)，并且從開封到溫度上升2℃所用的時(shí)間長短來衡量青貯飼料有氧穩(wěn)定性的好壞[9]。

本試驗(yàn)旨在通過向新鮮玉米秸稈中添加具有分解纖維素能力的霉菌，在延遲密封的過程中，將玉米秸稈中的部分纖維素降解為可溶性糖，為乳酸菌提供發(fā)酵底物，加速乳酸菌發(fā)酵進(jìn)程，以期提高玉米秸稈的青貯品質(zhì)。并通過開封后有機(jī)酸、pH值以及溫度的檢測(cè)，評(píng)價(jià)微生物接種劑和延遲密封對(duì)青貯玉米秸稈有氧穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 玉米秸稈

試驗(yàn)原料取自江西省修水縣中國農(nóng)業(yè)大學(xué)修水教授工作站，完熟期新鮮玉米秸稈。

1.1.2 微生物接種劑

試驗(yàn)所用乳酸菌為本實(shí)驗(yàn)室分離純化的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum KM005155）。所用霉菌為黑曲霉（Aspergillus nigerCGMCC 3.1858）和里氏木霉（Trichoderma reeseiCGMCC 3.3711），購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)對(duì)照組（CK）和乳酸菌組（LAB）、黑曲霉+乳酸菌組（As+LAB）、里氏木霉+乳酸菌組（Tr+LAB）以及黑曲霉+里氏木霉+乳酸菌組（As+Tr+LAB）添加組，共5組，每組3個(gè)重復(fù)。微生物接種劑按照原料鮮重的50 ml/kg添加，對(duì)照組添加同等量的蒸餾水，接種后，分別延遲0、24、48 h后抽真空密封。于貯藏第56 d開封，進(jìn)行發(fā)酵品質(zhì)及化學(xué)成分分析以及有氧穩(wěn)定性試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 微生物接種劑的制備

將保藏乳酸菌菌種活化后轉(zhuǎn)接一環(huán)于MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃、120 r/min搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，活菌數(shù)達(dá)到1×109cfu/ml。黑曲霉和里氏木霉則以孢子懸浮液的形式進(jìn)行接種，其制備方法為：將保藏菌株轉(zhuǎn)接一環(huán)于PDA培養(yǎng)基上，放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入20 ml無菌水，用涂布棒輕輕刮掉孢子，四層無菌紗布過濾到滅菌的三角瓶內(nèi)，加入滅菌的玻璃珠分散孢子后，適當(dāng)稀釋，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使孢子數(shù)目處于107cfu/ml，4℃條件下保藏備用。

1.3.2 青貯飼料的調(diào)制

將收獲的新鮮玉米秸稈切碎至1～2 cm，根據(jù)1.2節(jié)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加不同的微生物接種劑充分混勻后，裝入200×150 mm的青貯專用聚乙烯袋，每袋約200 g，分別于0、24、48 h后，抽真空密封，室溫條件下(18～25 ℃)避光貯藏。

1.3.3 青貯飼料的有氧穩(wěn)定性試驗(yàn)

將開封后的青貯玉米秸稈每袋各取出100 g，充分混勻后放入保溫材料桶中，將溫度傳感器插入樣品中心進(jìn)行溫度監(jiān)測(cè)，溫度數(shù)據(jù)的采集使用data Taker DT85采集裝置（澳大利亞 Datataker）進(jìn)行測(cè)定，采集時(shí)間設(shè)置為1 h；定期混勻取樣分析（根據(jù)具體變質(zhì)情況確定取樣時(shí)間）；當(dāng)樣品溫度高于環(huán)境溫度2℃時(shí)視為樣品變質(zhì)，在變質(zhì)時(shí)取樣進(jìn)行分析。

1.3.4 測(cè)定項(xiàng)目和分析方法

青貯袋開封后，將青貯料取出并充分混勻。取10 g樣品裝入滅菌的聚乙烯袋，于超凈工作臺(tái)內(nèi)加入90 ml滅菌去離子水，用無菌均質(zhì)器處理1 min，浸提3 h后，再通過4層紗布及定性濾紙過濾，得到青貯飼料浸提液，用于pH值測(cè)定及微生物的稀釋平板菌落計(jì)數(shù)。剩余青貯飼料樣品于65℃鼓風(fēng)干燥48 h后，測(cè)定干物質(zhì)（DM），粉碎過1 mm篩備用。pH值用pH計(jì)（Mettler To?ledo-S20,Switzerland）測(cè)定；微生物組成采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定[10]；粗蛋白質(zhì)（CP）采用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定[11]；中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）采用范式纖維法進(jìn)行測(cè)定[12]；NH3-N采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定[13]；可溶性碳水化合物（WSC）采用蒽酮硫酸法進(jìn)行測(cè)定[14]；有機(jī)酸采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 21.0的 two-way anova分析微生物接種劑及延遲密封以及二者的交互作用對(duì)玉米秸稈青貯微生物組成、發(fā)酵品質(zhì)、化學(xué)成分及開封后發(fā)生有氧變質(zhì)時(shí)的發(fā)酵品質(zhì)和化學(xué)成分的影響；多重比較采用Duncan's方法，顯著水平設(shè)置為P＜0.05。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 玉米秸稈的原料特性(見表1)

表1 青貯玉米秸稈原料化學(xué)組成(%)

玉米秸稈的化學(xué)組成如表1所示。新鮮玉米秸稈的DM含量為25.28%；而WSC含量較低，僅為5.83%DM。

2.2 玉米秸稈青貯的微生物組成（見表2）

如表2所示，微生物接種劑對(duì)玉米秸稈青貯的乳酸菌和好氧細(xì)菌的數(shù)量無顯著影響（P＞0.05），但顯著增加了酵母菌數(shù)量（P＜0.05）；延遲密封對(duì)青貯微生物群落影響顯著（P＜0.05），隨著延遲密封時(shí)間的增長，乳酸菌數(shù)量顯著上升，酵母菌數(shù)量顯著下降（P＜0.05）。所有處理組中均未檢測(cè)到霉菌及腸細(xì)菌。

表2 微生物接種劑和延遲密封對(duì)玉米秸稈青貯微生物組成的影響(log10cfu/g FM)

2.3 玉米秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)（見表3）

表3 微生物接種劑和延遲密封對(duì)玉米秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

所有試驗(yàn)組的發(fā)酵品質(zhì)良好，表現(xiàn)在pH值低于3.8，氨態(tài)氮占總氮的比值低于10%（見表3）。與CK組相比，添加微生物接種劑對(duì)pH值影響不顯著（P＞0.05），但對(duì)有機(jī)酸和氨態(tài)氮含量的影響顯著(P＜0.05)。其中添加Tr組的乳酸含量高于其他處理組；Tr+LAB組的乙酸含量則低于除CK組外的其他組；添加As+Tr+LAB組的丙酸和丁酸含量最低。延遲密封時(shí)間對(duì)pH值影響顯著(P＜0.05)，隨著密封時(shí)間的延遲，pH值顯著上升。微生物接種劑和延遲密封時(shí)間對(duì)青貯飼料中氨態(tài)氮含量影響均顯著（P＜0.05），其中Tr+LAB組的氨態(tài)氮含量高于其他微生物接種組，而As+Tr+LAB組的氨態(tài)氮含量與CK組無顯著差異；另外，隨著延遲密封時(shí)間的增長，氨態(tài)氮含量也顯著上升（P＜0.05）。

2.4 玉米秸稈青貯的化學(xué)成分(見表4)

表4 微生物添加劑和延遲密封對(duì)玉米秸稈青貯化學(xué)成分的影響

由表4可知，經(jīng)過56 d發(fā)酵后的玉米秸稈隨著延遲密封時(shí)間的增長，DM含量顯著下降（P＜0.05），NDF、ADF、CP含量顯著上升（P＜0.05）；對(duì)于微生物接種劑，除了As+Tr+LAB組的NDF含量顯著下降外，其他組各成分均無顯著影響。

2.5 玉米秸稈有氧狀態(tài)下的發(fā)酵品質(zhì)和化學(xué)成分(見表5)

發(fā)酵56 d的玉米秸稈開封后，處理組和CK組在延遲0 h和延遲48 h密封條件下開封后均在144 h發(fā)生變質(zhì)，而延遲24 h密封條件下的各組開封后均在160 h發(fā)生有氧變質(zhì)。變質(zhì)時(shí)的品質(zhì)和化學(xué)成分如表5所示。經(jīng)過24 h延遲密封后的玉米秸稈在160 h發(fā)生變質(zhì)時(shí)的pH值最低，保留的乳酸含量最高；NDF、ADF含量最低，CP含量最高。

3 討論

3.1 玉米秸稈的原料特性

玉米秸稈是收獲玉米后的副產(chǎn)品，水分含量75%左右，秸稈中的主要成分是木質(zhì)纖維素，由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，是反芻動(dòng)物良好的粗飼料來源。本試驗(yàn)的玉米秸稈中，CP含量7.41%DM，約為風(fēng)干玉米秸稈的2倍[1]，約為全株玉米青貯的85%；WSC含量5.83%DM，約為全株玉米青貯的35%；NDF（57.64%DM）和ADF（31.48%DM）含量均高于全株玉米青貯[3]。

表5 青貯玉米秸稈在有氧條件下的發(fā)酵品質(zhì)和化學(xué)成分分析

乳酸菌作為乳酸發(fā)酵的啟動(dòng)菌，在青貯過程中起著主導(dǎo)作用。一般情況下，當(dāng)原料表面附著乳酸菌數(shù)量達(dá)到或超過105cfu/g FM時(shí)，才能確保青貯的順利進(jìn)行[16]。制作青貯飼料時(shí)，要使乳酸菌能夠快速生長繁殖，青貯原料應(yīng)具有適宜的DM含量、一定的WSC含量及較低的緩沖能[17]。本試驗(yàn)中的玉米秸稈中WSC含量僅有5.83%DM，為了提高其發(fā)酵品質(zhì)，添加了乳酸菌和能產(chǎn)生纖維素分解酶的曲霉、木霉等真菌。Sun等[18]研究了纖維素酶和乳酸菌對(duì)玉米秸稈不同部位青貯的影響，得出纖維素酶能夠提高乳酸含量，降低DM、NDF及CP損失。本試驗(yàn)接種乳酸菌以及黑曲霉和里氏木霉，獲得了同樣的效果。

3.2 微生物接種劑及延遲密封對(duì)玉米秸稈青貯微生物群落的影響

添加微生物接種劑對(duì)乳酸菌的數(shù)量沒有顯著影響，這可能與玉米秸稈原料本身附著的乳酸菌有關(guān)。經(jīng)過56 d貯藏，酵母菌的數(shù)量顯著降低，但添加霉菌促進(jìn)了酵母菌的生長。隨著延遲密封時(shí)間的增長，乳酸菌數(shù)量顯著上升，酵母菌數(shù)量顯著下降，表明霉菌分泌的纖維素酶起了一定的作用，導(dǎo)致纖維素降解為能夠被乳酸菌吸收利用的WSC，從而促進(jìn)了乳酸菌的生長繁殖[19]。

3.3 微生物接種劑和延遲密封對(duì)玉米秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

添加微生物接種劑后玉米秸稈青貯pH值在3.63～3.68之間，和CK組的3.58相比沒有顯著差異（P＞0.05），這可能與本試驗(yàn)所用的玉米秸稈原料水分適宜等條件有關(guān)。添加有Tr組的乳酸含量高于其他處理組，表明里氏木霉分泌的纖維素酶將纖維素分解后促使乳酸菌發(fā)酵，提高了乳酸含量；Tr+LAB組的乙酸含量則低于除CK組外的其他組；添加As+Tr+LAB組的丙酸和丁酸含量則最低，說明不同的微生物接種劑對(duì)有機(jī)酸各成分的影響不同，但總體來看As+Tr+LAB組能有效改善玉米秸稈的青貯品質(zhì)。

本試驗(yàn)中，延遲密封對(duì)玉米秸稈的青貯品質(zhì)沒有改善作用，但隨著延遲時(shí)間的增長，乳酸菌數(shù)量顯著上升，酵母菌數(shù)量顯著下降，這可能對(duì)開封后的有氧穩(wěn)定性有一定的促進(jìn)作用。

3.4 微生物接種劑和延遲密封對(duì)玉米秸稈青貯營養(yǎng)成分的影響

添加有里氏木霉組的DM損失顯著高于CK組，和LAB組、As+Tr+LAB組差異不顯著，說明微生物接種劑會(huì)造成青貯原料的干物質(zhì)損失，但即使在不考慮干物質(zhì)損失的情況下，As+Tr+LAB組的NDF、ADF含量也顯著低于CK組，表明As+Tr+LAB組合降解了部分纖維素，將其分解后促使乳酸菌發(fā)酵提高了乳酸含量。隨著延遲密封時(shí)間的增長，NDF、ADF和CP含量顯著上升，且延遲48 h密封的CP、NDF及ADF含量略高于CK組，這可能是由于隨著密封時(shí)間的延遲，酵母、霉菌等好氧微生物對(duì)原料中可溶性碳水化合物和纖維素的利用造成的基質(zhì)損失，導(dǎo)致其他組分在干樣中的相對(duì)含量升高。

3.5 微生物接種劑和延遲密封對(duì)玉米秸稈青貯有氧穩(wěn)定性的影響

添加微生物接種劑不會(huì)改變玉米秸稈青貯的有氧穩(wěn)定性，表現(xiàn)在添加微生物接種劑與CK組同時(shí)變質(zhì)，但延遲24 h后密封發(fā)酵的玉米秸稈比延遲0 h和48 h密封后的玉米秸稈有氧穩(wěn)定性更好，這可能與延遲24 h霉菌在一定程度上的萌發(fā)抑制了酵母的大量繁殖有關(guān)。

4 結(jié)論

復(fù)合接種黑曲霉、里氏木霉和乳酸菌可以顯著提高玉米秸稈的青貯發(fā)酵品質(zhì)；延遲密封能夠顯著改變玉米秸稈青貯的微生物群落，且延遲24 h密封有利于玉米秸稈青貯的有氧穩(wěn)定性，但對(duì)玉米秸稈青貯品質(zhì)的提高沒有促進(jìn)作用。