■ 劉 星 劉姍姍 殷海松 喬長晟

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.天津市現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300350)

β-胡蘿卜素作為一種飼料添加劑能夠改變飼料顏色，具有增加畜類和禽類的食欲；增強(qiáng)某些水產(chǎn)品如蝦類、蟹類的色澤；能夠促進(jìn)動(dòng)物生長，提高肉類品質(zhì)及其產(chǎn)率；提高雞、鴨等禽類的產(chǎn)蛋率、受精率及蛋的孵化率，并能改善其蛋的色澤；提高馬、牛和豬等牲畜的產(chǎn)仔率等作用。因此，被廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè)。由于化學(xué)合成的β-胡蘿卜素其生產(chǎn)過程可能會(huì)產(chǎn)生對(duì)人或動(dòng)物有害的中間副產(chǎn)物，天然提取法提取的β-胡蘿卜素價(jià)格相對(duì)較為昂貴，因此，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)β-胡蘿卜素作為飼料添加劑具有廣泛的應(yīng)用前景[1-3]。目前，利用三孢布拉霉發(fā)酵β-胡蘿卜素具有工業(yè)化生產(chǎn)潛力。三孢布拉霉（Blakeslea trispora）是一種異宗接合的真菌，有正（+）、負(fù)（-）兩種單性菌株。單獨(dú)的正菌或者單獨(dú)的負(fù)菌產(chǎn)β-胡蘿卜素能力很低，幾乎不產(chǎn)β-胡蘿卜素。當(dāng)兩種單性菌株按一定比例混合后，其在有性繁殖階段會(huì)產(chǎn)生性激素三孢酸。三孢酸能夠刺激菌體使其β-胡蘿卜素產(chǎn)量大大增高[4]。通過在篩選培養(yǎng)基中添加一定含量的三孢酸，刺激菌體產(chǎn)生β-胡蘿卜素，從而使菌株形成的菌落由無色變?yōu)辄S色，并且，菌株利用三孢酸產(chǎn)β-胡蘿卜素能力越強(qiáng)，其形成的菌落顏色越深。根據(jù)經(jīng)過紫外誘變前后形成的菌落顏色深淺對(duì)比，從誘變菌落中挑選較為經(jīng)誘變的菌落顏色深的菌落做為目的菌株，從而大大提高篩選高產(chǎn)β-胡蘿卜素菌株的效率。對(duì)工業(yè)微生物發(fā)酵法產(chǎn)飼料添加劑β-胡蘿卜素的應(yīng)用具有重要意義[5-8]。

1 材料與方法

1.1 菌種

三孢布拉霉（Blakeslea trispora）正（+）菌株、負(fù)（-）菌株，由天津科技大學(xué)微生物保藏中心保藏。

1.2 試劑

玉米淀粉、黃豆餅粉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、豆油、工業(yè)玉米漿、土豆、葡萄糖、酵母浸粉、瓊脂、乳化劑OP、三孢酸標(biāo)品（含量≥98%）、β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 斜面培養(yǎng)基

土豆20%、葡萄糖2%、磷酸氫二鉀0.05%、酵母浸粉0.1%、瓊脂2%，pH值6.5～7.2（121℃滅菌20 min）。

1.3.2 種子培養(yǎng)基

玉米淀粉3.5%、黃豆餅粉2.3%、磷酸二氫鉀0.15%、七水硫酸鎂0.01%、豆油0.5%、工業(yè)玉米漿1%、pH值自然，500 ml三角瓶裝100 ml(121 ℃滅菌20 min)。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

玉米淀粉3.0%、黃豆餅粉2.4%、磷酸二氫鉀0.25%、七水硫酸鎂0.02%、豆油3.5%、工業(yè)玉米漿2.0%、VB10.005%、檸檬酸三鈉0.3%，pH值7.0（121℃滅菌20 min）。

1.3.4 平板初篩培養(yǎng)基

土豆20%、葡萄糖2%、磷酸氫二鉀0.05%、酵母浸粉0.1%、瓊脂2%、0.1%三孢酸、0.05%乳化劑OP，pH值7.0。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 斜面產(chǎn)孢培養(yǎng)

將正、負(fù)菌株分別接種至斜面培養(yǎng)基，28℃，避光培養(yǎng)5～7 d。

1.4.2 搖瓶種子培養(yǎng)

在無菌條件下，分別從正、負(fù)菌株試管斜面用接種鏟沿菌苔表面產(chǎn)下約小拇指蓋大小的菌苔，接種至裝有100 ml種子培養(yǎng)基的500 ml搖瓶中。27℃、200 r/min，搖床培養(yǎng)48 h。

1.4.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將正、負(fù)菌株按1∶4比例混合，共10%的接種量，在無菌條件下，用滅過菌的10 ml移液管接種至發(fā)酵培養(yǎng)基。27 ℃、200 r/min，初始pH值7.0，500 ml裝液100 ml，搖床振蕩培養(yǎng)4 d。

1.4.4 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用分析天平精確稱取0.010 0 gβ-胡蘿卜素標(biāo)品，溶于100 ml乙酸乙酯中。精確量取1 ml上述溶液,乙酸乙酯定容至100 ml，得到1 mg/lβ-胡蘿卜素標(biāo)液。再分別吸取1、2、3、4、5、6、7、8、9 ml上述溶液，分別用乙酸乙酯定容至10 ml，以乙酸乙酯為空白樣，分別于454 nm處測(cè)其吸光值，得到一條y=0.194 7x，r2=0.999 4的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 干菌體的獲得

用800目尼龍濾布過濾種子培養(yǎng)與發(fā)酵培養(yǎng)的產(chǎn)物，保留菌體。將菌體用蒸餾水清洗2～3次后，用800目尼龍濾布將菌體裹住，輕輕擠壓，將菌體間的水分盡量擠出。將殘余水分基本擠干后，在電子天平上稱量，得到菌體濕重。將濕菌體放入已經(jīng)恒重過的培養(yǎng)皿中，在-40℃的條件下真空干燥至恒重，稱量其重量。

1.4.6 β-胡蘿卜素含量的測(cè)定

精確稱取1.4.2得到的菌體，烘干，精確稱取0.03 g。置于干凈的研缽中。在陰暗避光的條件下，向研缽中加入2 ml的乙酸乙酯溶液，在通風(fēng)櫥中，快速研磨至菌體無色。將上述溶液全部吸取到25 ml容量瓶中，乙酸乙酯定容，混勻。精確吸取上述溶液1 ml至10 ml容量瓶，乙酸乙酯定容，搖勻。以乙酸乙酯為空白樣，用分光光度計(jì)454 nm處測(cè)其吸光值，并根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其β-胡蘿卜素含量。

1.4.7 紫外誘變出發(fā)菌株的確定

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1%的三孢酸，分別將正、負(fù)菌株單獨(dú)接種至上述培養(yǎng)基，單獨(dú)發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)方法1.4.6測(cè)其β-胡蘿卜素產(chǎn)量。以β-胡蘿卜素產(chǎn)量為指標(biāo)，確定出發(fā)菌株。

1.4.8 孢子懸液的制備

無菌條件下，新鮮的孢子斜面中加入一定量的無菌水，用接種針將孢子輕輕刮下。用滅過菌的在漏斗管道中塞有一定量棉花的漏斗除去菌絲體。將所得孢子液吸入裝有100 ml無菌水（10顆玻璃珠）的500 ml錐形瓶中。200 r/min振蕩5 min，使孢子分布均勻。將上述孢子懸液用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)后，按一定比例，將孢子濃度稀釋到 106個(gè)/ml。

1.4.9 致死率曲線繪制

將紫外誘變箱中的30 W紫外燈開啟預(yù)熱30 min之后，使紫外燈波長穩(wěn)定，同時(shí)對(duì)箱內(nèi)環(huán)境進(jìn)行滅菌。將制備的孢子懸液在無菌條件下分裝至滅過菌的6 cm平板中，每個(gè)平板里裝液量為5 ml(平板中裝有轉(zhuǎn)子)。將含有孢子液及轉(zhuǎn)子的平板置于紫外誘變箱中的磁力攪拌器上，打開磁力攪拌器，攪拌。掀開培養(yǎng)皿蓋，開始紫外照射孢子懸液。計(jì)時(shí)。分別照射1、2、3、4、5、6、7、8 min后，分別將培養(yǎng)皿蓋子蓋上，取出培養(yǎng)皿。分別將上述溶液孢子液稀釋涂布于平板上，菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率，繪制致死率曲線。

1.4.10 紫外誘變處理

根據(jù)1.4.5的致死率選擇紫外照射時(shí)間進(jìn)行紫外處理。處理方法參照1.4.5。

1.4.11 平板初篩

根據(jù)方法1.4.6對(duì)孢子懸液進(jìn)行紫外誘變處理，稀釋涂布在篩選培養(yǎng)基上，避光培養(yǎng)3～5 d后，至新長出的菌落成熟。與未經(jīng)照射的孢子液在篩選平板上形成的菌落進(jìn)行顏色對(duì)比。從中挑選出較未經(jīng)紫外照射的孢子液形成的菌落顏色較深的菌落。將這些菌落進(jìn)行編號(hào)后，用接種針將其挑起，在無菌環(huán)境下，挑至斜面培養(yǎng)基上，28℃，避光培養(yǎng)5～7 d，至孢子斜面成熟。得到目的菌株。

1.4.12 菌種純化

將1.4.11得到的目的菌株與出發(fā)菌株的孢子洗下，稀釋涂布于篩選培養(yǎng)基。28℃，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)3～5 d后，形成菌落。比較菌落顏色深淺，將目的菌株形成的菌落顏色較出發(fā)菌株形成菌落顏色深的菌落挑下，接種于PDA斜面，28℃、避光培養(yǎng)5～7 d，至孢子斜面成熟。得到純化的目的菌株。

1.4.13 搖瓶復(fù)篩

將經(jīng)過純化后的目的菌落在斜面培養(yǎng)基上生長至孢子成熟后，無菌條件下，用接種鏟鏟下一小塊菌苔，接種于種子培養(yǎng)基。另一種單性菌株也按上述方法接種于種子培養(yǎng)基。27℃、220 r/min，培養(yǎng)2 d。按方法1.4.3進(jìn)行發(fā)酵。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外誘變處理出發(fā)菌株的確定（見圖1）

圖1 三孢酸對(duì)正、負(fù)菌株產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

由圖1可看出，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加三孢酸時(shí)，正菌發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高達(dá)到46.24 mg/l；負(fù)菌發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高達(dá)到57.23 mg/l。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了0.1%的三孢酸之后，正菌的β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到63.28 mg/l；負(fù)菌的β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高達(dá)186.27 mg/l。由以上數(shù)據(jù)可以分析出，三孢酸能夠刺激正菌和負(fù)菌產(chǎn)生β-胡蘿卜素，使其產(chǎn)量均有所提高，但對(duì)負(fù)菌的影響效果顯著。由此推測(cè)，負(fù)菌才是生產(chǎn)β-胡蘿卜素的主產(chǎn)菌株；正菌起到的作用可能是與負(fù)菌在有性繁殖階段配合負(fù)菌產(chǎn)生性激素三孢酸，從而刺激菌株產(chǎn)生β-胡蘿卜素。因此，選擇負(fù)菌作為紫外誘變的出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變處理。

2.2 致死率曲線（見圖2）

圖2 致死率曲線

誘變劑量一般選擇致死率在70%～80%之間時(shí)對(duì)應(yīng)的誘變劑量。但由于三孢布拉霉菌體細(xì)胞為多核單細(xì)胞結(jié)構(gòu)，經(jīng)過誘變得到的高產(chǎn)β-胡蘿卜素菌株容易發(fā)生退化，因此，選擇致死率稍高的誘變劑量。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，選擇致死率為約88%時(shí)的紫外照射時(shí)長，即紫外照射4 min。

2.3 平板初篩（見圖3）

三孢布拉霉負(fù)菌在PDA平板上形成的菌落顏色呈無色，在添加了三孢酸的平板上形成的菌落呈黃色，初篩結(jié)果說明，三孢酸的加入能夠刺激菌體產(chǎn)生β-胡蘿卜素。經(jīng)過紫外誘變處理之后形成的菌落由于其各自利用三孢酸產(chǎn)β-胡蘿卜素的能力不同，其產(chǎn)生的菌落顏色深淺不一。利用三孢酸產(chǎn)β-胡蘿卜素能力高的菌株，會(huì)形成顏色較出發(fā)菌株形成的菌落顏色深的菌落，如圖3C箭頭所指菌落。將這種菌落挑至斜面培養(yǎng)基并對(duì)其編號(hào)，得到目的菌株。將得到的菌株進(jìn)行分離純化，得到較純化的目的菌株。

2.4 第一輪搖瓶復(fù)篩

將經(jīng)過純化的目的菌株進(jìn)行第一輪搖瓶復(fù)篩，測(cè)定其β-胡蘿卜素產(chǎn)量。由第一輪搖瓶復(fù)篩結(jié)果可以看出，根據(jù)菌落顏色深淺進(jìn)行平板初篩得到目的菌株，將目的菌株經(jīng)過搖瓶發(fā)酵測(cè)定其β-胡蘿卜素產(chǎn)量后，大部分的目的菌株的β-胡蘿卜素產(chǎn)量都較出發(fā)菌株有所提高，說明利用這種方法篩選高產(chǎn)β-胡蘿卜素菌株是可行的。但存在少量的菌株產(chǎn)β-胡蘿卜素能力較出發(fā)菌株有所下降的現(xiàn)象。造成這種現(xiàn)象的主要原因可能是因?yàn)榫觌m然利用三孢酸產(chǎn)β-胡蘿卜素的能力有所提高，但其與正菌混合后，在有性繁殖階段產(chǎn)三孢酸的能力有所下降，造成最后β-胡蘿卜素總產(chǎn)量下降；也存在對(duì)菌落顏色深淺判斷失誤的可能性，沒有較準(zhǔn)確的挑選出目的菌落。

圖3 平板初篩結(jié)果

2.5 第二輪搖瓶復(fù)篩

從第一輪搖瓶復(fù)篩得到的目的菌株中，挑選出β-胡蘿卜素產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高30%以上的菌株(見表1)。

表1 第二輪搖瓶復(fù)篩結(jié)果

2.6 遺傳穩(wěn)定性分析

經(jīng)過紫外誘變后的目的菌株，可能會(huì)由于在傳代過程中，由于遺傳性狀的不穩(wěn)定性導(dǎo)致菌株產(chǎn)β-胡蘿卜素能力發(fā)生退化。因此，將經(jīng)過第二輪搖瓶復(fù)篩的菌株連續(xù)傳五代，分析其每一代產(chǎn)β-胡蘿卜素能力變化。經(jīng)過連續(xù)五次傳代后，其每代產(chǎn)β-胡蘿卜素能力見表2。

表2 遺傳穩(wěn)定性分析（mg/l）

由表2數(shù)據(jù)可知，73#菌株第一代β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高，較出發(fā)菌株提高59.72%，但經(jīng)過連續(xù)五代傳代之后，其β-胡蘿卜素產(chǎn)量有所降低，降到了640.05 mg/l，較28#菌株的第五代產(chǎn)量694.26 mg/l低。并且，28#菌株在傳代過程中，其每代β-胡蘿卜素產(chǎn)量均較為穩(wěn)定。因此，選擇28#菌株作為目的菌株，經(jīng)過五次傳代后，其β-胡蘿卜素產(chǎn)量為694.26 mg/l，較出發(fā)菌株β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高52.01%。

3 結(jié)論

確立了以負(fù)菌作為誘變出發(fā)菌株的育種思路，驗(yàn)證了利用三孢酸篩選β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的可行性。負(fù)菌株經(jīng)過紫外誘變處理，平板初篩，分離純化，搖瓶復(fù)篩，遺傳穩(wěn)定性分析后，從多個(gè)目的菌株中篩選出一株遺傳性能穩(wěn)定，較出發(fā)菌株產(chǎn)β-胡蘿卜素能力提高52.01%，產(chǎn)量達(dá)694.26 mg/l的誘變菌株。