■喬 偉

（北京盛拓達(dá)生物技術(shù)有限公司，北京100081）

大豆是一種優(yōu)秀的植物蛋白源，蛋白質(zhì)含量高，且氨基酸平衡性好，是性價(jià)比高的優(yōu)質(zhì)動(dòng)物飼料原料，在魚(yú)粉價(jià)格高漲的今天，更是一種優(yōu)質(zhì)原料。然而，大豆本身所含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響機(jī)體對(duì)養(yǎng)分的吸收利用與腸道健康。大豆中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子為大豆抗原蛋白、大豆凝集素和胰蛋白酶抑制因子，它們都是大豆蛋白組成的重要成分，本文主要闡述大豆三大抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)腸道健康的影響與新型蛋白酶解決方案，為大豆蛋白在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 大豆蛋白類(lèi)三大抗?fàn)I養(yǎng)因子

1.1 大豆抗原蛋白

大豆中的抗原蛋白又稱(chēng)致敏蛋白，主要包括大豆球蛋白（glycinin）和三種伴大豆球蛋白（如：α-conglycinin、β-conglycinin和γ-conglycinin），這四種大豆球蛋白均能引起斷奶仔豬過(guò)敏反應(yīng)，其中g(shù)lycinin和βconglycinin是大豆中免疫原性最強(qiáng)的兩種抗原蛋白。大豆球蛋白是六聚體復(fù)合物，相對(duì)分子質(zhì)量介于300～380 kDa之間。在大豆蛋白質(zhì)中，大豆球蛋白含量最高，是大豆中的主要貯藏蛋白，也是最大的單體成分，占大豆籽實(shí)的25%～35%，是一種聚合蛋白質(zhì)，含糖蛋白較少，具有良好的熱穩(wěn)定性。

β-伴大豆球蛋白是三聚體，相對(duì)分子質(zhì)量150～200 kDa，占大豆總量的10%～12.7%，大豆蛋白質(zhì)含量的30%，其含量?jī)H次于大豆球蛋白，是導(dǎo)致大豆過(guò)敏的另一種主要抗原蛋白。β-伴大豆球蛋白同大豆球蛋白一樣也具有良好的干熱穩(wěn)定性，100℃條件干炒對(duì)其抗原活性幾乎沒(méi)有影響。孫澤威等（2006）研究表明，120℃、7.5 min蒸汽熱處理大豆，能使大豆球蛋白失去免疫活性，但對(duì)β-伴大豆球蛋白的活性來(lái)說(shuō)基本不能失活。而在濕熱處理過(guò)程中，70～80℃為β-伴大豆球蛋白的變性溫度，溫度升高至80℃左右時(shí)，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生最大程度的變化，β-伴大豆球蛋白的剛性結(jié)構(gòu)發(fā)生部分解離，變?yōu)闊o(wú)規(guī)則的柔性結(jié)構(gòu)；到達(dá)100℃時(shí)，亞基結(jié)構(gòu)基本破壞。體外酶解試驗(yàn)表明，β-伴大豆球蛋白酶解產(chǎn)物中分子量為10～20 kDa的這部分肽段對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶具有一定抵抗力。

大豆球蛋白分子結(jié)構(gòu)緊密，大量酶切位點(diǎn)藏于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，很難被蛋白酶水解。因此，大豆球蛋白即有熱穩(wěn)定性也有不被內(nèi)源蛋白酶降解的特性。大豆抗?fàn)I養(yǎng)作用的30%由大豆球蛋白引起。

1.2 胰蛋白酶抑制因子

生大豆抗?fàn)I養(yǎng)作用的40%是由胰蛋白酶抑制因子（trypsin inhibitors，TI）引起的，按照結(jié)構(gòu)分胰蛋白酶抑制因子大約有7種，但目前只有庫(kù)尼茲大豆胰蛋白酶抑制因子（Kunitz trypsin inhibitor，KTI）和包曼-伯克蛋白酶抑制因子（Bowman-Birk proteinase inhibitor，BBI）得到較廣泛的關(guān)注和詳細(xì)研究。生大豆中含有1.4%的KTI和0.6%的BBI（李德發(fā)，2003）。其中KTI含有181個(gè)氨基酸殘基，含2個(gè)二硫鍵，1個(gè)活性中心，不溶于乙醇，易被酸和蛋白酶失活，由于分子內(nèi)的二硫鍵含量少，所以對(duì)熱也比較敏感，一般80℃短時(shí)間加熱即可使其變性，而在90℃時(shí)就發(fā)生不可逆失活，可以與胰蛋白酶1∶1進(jìn)行結(jié)合。BBI含71個(gè)氨基酸殘基，7個(gè)二硫鍵，有2個(gè)活性中心，BBI不溶于丙酮，對(duì)熱、酸的熱穩(wěn)定性好，即使在105℃干熱10 min仍可以保持活性，且可以與胰蛋白酶1∶2進(jìn)行結(jié)合，或者同時(shí)結(jié)合一個(gè)胰蛋白酶和一個(gè)胰凝乳蛋白酶。

1.3 大豆凝集素

大豆凝集素(SBA)主要存在于大豆子葉細(xì)胞中，約為大豆蛋白質(zhì)總量的10%，是具有特異性結(jié)合能力的糖蛋白，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性非常高，具有凝集動(dòng)物紅細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化等生物活性，是大豆中含量較高的生物活性蛋白質(zhì)。大豆抗?fàn)I養(yǎng)作用的20%由SBA引起。它通過(guò)與動(dòng)物小腸上皮細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而破壞小腸正常結(jié)構(gòu)來(lái)發(fā)揮其抗?fàn)I養(yǎng)作用，影響體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收利用、抑制動(dòng)物生長(zhǎng)、引發(fā)腹瀉等病理變化。

大豆凝集素具有很強(qiáng)的抗熱變性能力，很多傳統(tǒng)的熱處理方法都不能使它有效失活。研究表明，即使經(jīng)過(guò)140℃、15 min的干熱處理，其活性下降的程度也較小。大豆凝集素經(jīng)濕熱處理后，80℃時(shí)其活性沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，從95℃、25 min開(kāi)始活性明顯喪失，在95℃、35 min或120℃、15 min其活性完全喪失，這是因?yàn)槟厥且环N糖蛋白，有不可逆熱變性的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，所以濕熱處理可以作為消除凝集素抗?fàn)I養(yǎng)作用的有效方法。

2 大豆三大抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)腸道健康的影響

2.1 大豆抗原蛋白對(duì)腸道健康的影響

大豆球蛋白在腸道內(nèi)的分布受其濃度、抗原活性、動(dòng)物健康等多方面因素的影響。在健康仔豬腸道中，大豆球蛋白含量呈先降后升的U字型變化趨勢(shì)；從十二指腸到空腸中部顯著下降，而在空腸后部到回腸呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中回腸的含量最高，而空腸中部的含量最低。在小腸絨毛內(nèi)的大豆球蛋白濃度均極顯著高于隱窩和集合淋巴小結(jié)。

大豆球蛋白對(duì)仔豬腸道健康的影響與其腸上皮細(xì)胞通透性有關(guān)。使用大豆球蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的仔豬小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行刺激，結(jié)果表明大豆球蛋白能使仔豬小腸上皮細(xì)胞通透性增加。在一定劑量范圍內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活性與大豆球蛋白濃度呈依賴(lài)式升高，而細(xì)胞跨膜電阻值(TEER)則下降；高濃度大豆球蛋白可使仔豬小腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量降低。在水產(chǎn)動(dòng)物研究中也發(fā)現(xiàn)，飼糧添加一定量大豆球蛋白使不同食性魚(yú)類(lèi)腸道組織結(jié)構(gòu)完整性出現(xiàn)了不同程度的損傷，在鯉魚(yú)的前腸、后腸及草魚(yú)前腸和埃及胡子鲇后腸的小腸絨毛均有不同程度破損，固有層組織疏松而且斷裂。

β-伴大豆球蛋白具有內(nèi)在的免疫刺激能力，并能誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。β-伴大豆球蛋白可以通過(guò)誘導(dǎo)腸道氧化反應(yīng)影響腸道結(jié)構(gòu)及細(xì)胞通透性等，造成腸道損傷，并由此引發(fā)生長(zhǎng)不良、消化和吸收功能障礙，影響動(dòng)物腸道健康和正常生長(zhǎng)。Chen等(2011)給10日齡仔豬飼喂β-伴大豆球蛋白并結(jié)合仔豬小腸上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗(yàn)，通過(guò)分析指出，β-伴大豆球蛋白刺激能增加腸細(xì)胞應(yīng)激和炎癥蛋白質(zhì)的表達(dá)，通過(guò)抑制腸細(xì)胞的生長(zhǎng)，破壞細(xì)胞骨架，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡引起仔豬小腸腸道損傷。這在體外培養(yǎng)的仔豬小腸上皮細(xì)胞通透性研究中也得到了驗(yàn)證。Zhao等(2014)用不同濃度的β-伴大豆球蛋白對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞刺激測(cè)定其對(duì)上皮通透性、完整性、代謝活性、緊密連接分布和表達(dá)等的影響，結(jié)果表明，顯著減少反式上皮電阻(TEER)、代謝活性和堿性磷酸酶(ALP)活性，且呈劑量依賴(lài)性方式顯著增加；降低緊密連接mRNA的表達(dá)，免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞面積減小。對(duì)魚(yú)的研究也表明，β-伴大豆球蛋白降低建鯉飼料轉(zhuǎn)化率及體內(nèi)胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、肌酸激酶、鈉離子、K+-ATP酶、堿性磷酸酶的活性，β-伴大豆球蛋白減少腸細(xì)胞中谷胱甘肽(GSH)及抗氧化酶的含量，誘導(dǎo)炎癥和氧化，降低建鯉胰腺和腸道重量，減少腸道長(zhǎng)度，從而導(dǎo)致腸道消化吸收的功能障礙。研究表明，β-伴大豆球蛋白提取物可以破壞鯉魚(yú)腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，一定劑量β-伴大豆球蛋白能夠破壞鯉魚(yú)腸上皮細(xì)胞膜和線粒體膜，降低鯉魚(yú)腸上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)沉積，抑制鯉魚(yú)腸上皮細(xì)胞增殖。

2.2 胰蛋白酶抑制因子對(duì)腸道健康的影響

大豆胰蛋白酶抑制因子的抗?fàn)I養(yǎng)作用主要表現(xiàn)在降低蛋白質(zhì)消化率、引起胰腺增生和胰腺腫大、加劇氨基酸的不平衡、抑制動(dòng)物生長(zhǎng)等方面。

首先，胰蛋白酶抑制劑可與小腸液中胰蛋白酶特異性地結(jié)合生成無(wú)活性的復(fù)合物，降低胰蛋白酶的活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)消化率和利用率降低；腸道內(nèi)胰蛋白酶活性低時(shí)，引起胰腺機(jī)能亢進(jìn)，分泌更多的胰蛋白酶，補(bǔ)充至腸道中，這會(huì)導(dǎo)致胰腺增生和胰腺腫大。

其次，引起動(dòng)物體蛋白質(zhì)內(nèi)源性消耗，加劇氨基酸，尤其是含硫氨基酸的不平衡性。胰蛋白酶中含硫氨基酸豐富，胰蛋白酶大量補(bǔ)償性分泌會(huì)造成體內(nèi)含硫氨基酸內(nèi)源性的消失，而大豆中含硫氨基酸的含量并不高，這會(huì)加劇體內(nèi)氨基酸代謝不平衡，導(dǎo)致生長(zhǎng)受阻或停滯。胰蛋白酶抑制劑引起含硫氨基酸內(nèi)源性丟失是受到小腸黏膜分泌的一種激素——腸促胰酶肽(Cholecystokinin-Pancreozymin，CCK-PZ)調(diào)控的，腸促胰酶肽刺激胰腺腺體細(xì)胞分泌蛋白水解酶原(如胰蛋白酶原、糜蛋白酶原等)，腸促胰酶肽的分泌和小腸食糜中胰蛋白酶的含量呈負(fù)相關(guān)，即食糜中胰蛋白酶由于和胰蛋白酶抑制劑結(jié)合而減少時(shí)，腸促胰酶肽就分泌更多，因而刺激胰腺分泌更多的胰蛋白酶原至腸道中。這種機(jī)制稱(chēng)為胰腺分泌受腸道中胰蛋白酶數(shù)量的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。除胰腺增生性變化而增重外，還可引起胰腺細(xì)胞的變性。表現(xiàn)為腺細(xì)胞體積增大或數(shù)量增多，胞質(zhì)為酶原顆粒所充滿，也會(huì)有細(xì)胞的變性，即胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器排列不規(guī)則，酶原顆粒減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小囊擴(kuò)張、破碎并浮于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的半透明質(zhì)內(nèi)。

2.3 大豆凝集素對(duì)腸道健康的影響

大豆凝集素對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)有抑制作用，并隨動(dòng)物種類(lèi)、生理階段和飼喂量等而變化；影響動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，其中對(duì)氮代謝的影響明顯，尿氮損失隨著日糧凝集素水平的提高而明顯增加；同時(shí)對(duì)小腸結(jié)構(gòu)和功能有不良影響。

SBA可特異性結(jié)合動(dòng)物的上皮細(xì)胞，SBA作為一類(lèi)糖蛋白化合物對(duì)N-乙?；肴樘前泛桶肴樘怯刑禺愋缘淖R(shí)別作用。豬的下頜黏蛋白也可以與SBA結(jié)合，因?yàn)槠渲泻蠶-半乳糖胺在動(dòng)物腸上皮細(xì)胞表面，特別是腸微絨毛頂端的細(xì)胞表面恰好存在著N-乙?；肴樘前?，SBA能特異性與小腸上皮細(xì)胞結(jié)合，不同種屬動(dòng)物腸壁對(duì)SBA的集合能力有所差異，但在小腸中總體來(lái)說(shuō)呈降低趨勢(shì)。其中十二指腸濃度最高，而回腸濃度最低。采用生物素標(biāo)記技術(shù)及免疫組化技術(shù)研究不同動(dòng)物腸上皮SBA結(jié)合位點(diǎn)的分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在豬小腸內(nèi)SBA結(jié)合主要在絨毛邊緣及皺襞處的淋巴組織，隱窩內(nèi)也有少量分布；在小腸各段中也多有結(jié)合，但在空腸前段最強(qiáng)；SBA在兔空腸各段有較多結(jié)合位點(diǎn)分布，空腸是SBA最敏感部位，主要集中于小腸絨毛柱狀上皮細(xì)胞游離面；在雞小腸各段均有SBA結(jié)合位點(diǎn)分布，主要在上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞，在空腸前段到后段，杯狀細(xì)胞受體含量逐漸增加。

一定劑量的SBA與小腸上皮細(xì)胞的結(jié)合會(huì)引起動(dòng)物腸道結(jié)構(gòu)的損傷，改變其結(jié)構(gòu)。斷奶仔豬飼喂高濃度SBA可以增加腸道通透性，減少仔豬腸上皮緊密連接蛋白的表達(dá)。Li(2013)從細(xì)胞分子層面證明了大豆凝集素對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞機(jī)械屏障功能和緊密連接蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明凝集素處理增加體外培養(yǎng)的仔豬小腸上皮細(xì)胞膜的通透性，抑制細(xì)胞活力，降低緊密連接蛋白的表達(dá)水平，導(dǎo)致小腸上皮細(xì)胞機(jī)械屏障功能下降。

3 新型蛋白酶解決方案

早期對(duì)于大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子的處理方法，多為化學(xué)法，如熱乙醇提取等，但該類(lèi)方法所耗人力、物力太大，對(duì)環(huán)境污染大，化學(xué)試劑殘留、影響適口性，且會(huì)造成一定的養(yǎng)分損失，因此只限于科研。20世紀(jì)90年代后用熱處理如膨化等的方式較多，但只對(duì)熱敏性的抗?fàn)I養(yǎng)因子如胰蛋白酶抑制因子等有作用，且高溫處理對(duì)大豆中的營(yíng)養(yǎng)成分如維生素等損失較大，卻對(duì)熱穩(wěn)定的大豆抗原蛋白作用不明顯。近年來(lái)，用生物發(fā)酵的方式較多，降解抗原的效果也較好，但存在設(shè)備投入大、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、菌種變化大、產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定等多種因素，而且發(fā)酵過(guò)程會(huì)使大豆中的能量大量因微生物發(fā)酵生長(zhǎng)而消耗，降低大豆類(lèi)產(chǎn)品的能量?jī)r(jià)值。超級(jí)蛋白酶SP100（北京盛拓達(dá)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）是一種新型蛋白酶，是具有良好的熱穩(wěn)定性、pH值廣譜性、原料底物廣譜性，可以降解羽毛粉、醇溶蛋白，也對(duì)大豆中的三大抗?fàn)I養(yǎng)因子有較好的降解作用。

3.1 蛋白酶對(duì)大豆抗原蛋白的降解

針對(duì)大豆中的三大抗?fàn)I養(yǎng)因子，我們提出了完全不同于以往的研究，采用新型耐高溫蛋白酶SP100進(jìn)行處理的方式，可以有效降解大豆抗原蛋白，降解率可達(dá)90%左右，而且不會(huì)對(duì)大豆中的營(yíng)養(yǎng)成分有損害。該方式簡(jiǎn)單易行，用于飼料中，也可以用于發(fā)酵豆粕的發(fā)酵過(guò)程中。蛋白酶SP100對(duì)生大豆、豆粕、純抗原蛋白這三種形態(tài)存在的大豆蛋白和β-伴大豆球蛋白的降解效果如表1所示。因此可見(jiàn)，蛋白酶SP100在體外對(duì)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的降解率分別達(dá)94%和88%，如果在體內(nèi)，結(jié)合其內(nèi)源他酶的作用，降解率會(huì)更高。

表1 蛋白酶SP100對(duì)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的降解效果

3.2 蛋白酶對(duì)胰蛋白酶抑制因子和大豆凝集素的降解

將大豆凝集素和胰蛋白酶因子用蛋白酶水解后再電泳分析進(jìn)行研究，結(jié)果表明，蛋白酶SP100對(duì)大豆凝集素、胰蛋白酶抑制因子KTI和BBI都有良好降解效果。

3.3 蛋白酶對(duì)機(jī)體腸道健康的影響

Wang等（2008）在肉雞中的研究報(bào)道，在日糧中添加蛋白酶可改善肉雞的腸道形態(tài)，增加小腸絨毛高度，降低隱窩深度。

Wang(2011)用蛋白酶在斷奶仔豬上的研究結(jié)果表明，添加蛋白酶顯著降低回腸、盲腸和結(jié)腸中食糜氨態(tài)氮的含量（P＜0.05），降低盲腸和結(jié)腸中大腸桿菌的數(shù)量（P＜0.05），增加了乳酸桿菌的數(shù)量（P＜0.05），并降低斷奶仔豬結(jié)腸中總耗氧菌的數(shù)量（P＜0.05），增加總厭氧菌的數(shù)量（P＜0.05）。對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)影響的結(jié)果表明，蛋白酶可以顯著提高斷奶仔豬回腸絨毛高度與隱窩深度的比值（P＜0.05），降低空腸和回腸的隱窩深度（P＜0.05），從而表明蛋白酶可以改善腸道結(jié)構(gòu)健康，并促進(jìn)腸道有益菌群的繁殖，有利菌群平衡。

4 小結(jié)

大豆作為一種良好的植物蛋白源在飼料中具有重要的營(yíng)養(yǎng)地位，然而抗?fàn)I養(yǎng)因子嚴(yán)重影響了動(dòng)物腸道健康，刺激腸道產(chǎn)生不良反應(yīng)，破壞腸道的正常結(jié)構(gòu)，影響動(dòng)物腸道的消化、吸收、屏障和免疫功能。盛拓達(dá)公司新研發(fā)的蛋白酶SP100，可以有效的降解大豆中的三大抗?fàn)I養(yǎng)因子，減少它們對(duì)腸道健康的不良影響，促進(jìn)腸道有益微生物的繁殖，改善腸道結(jié)構(gòu)和健康。