■張文佳 張永根 吳 爽 薛世崇

（東北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，黑龍江哈爾濱 150030）

豆渣營養(yǎng)成分豐富，研究表明，約有30%的大豆固形物、20%的大豆蛋白以及11%的大豆油脂在加工過程中殘留在豆渣中。豆渣有相當高的利用價值，可用于作為優(yōu)良的反芻動物飼料。但是由于本身存在含水量大，容易腐敗變質，不容易儲存和運輸以及適口性差等缺點，導致不能夠很好地被利用，使得本身含有的大量營養(yǎng)物質被浪費。

前人的研究大多圍繞在通過利用豆渣的粗纖維作為微生物的碳源來生產(chǎn)菌體蛋白，從而使其成為優(yōu)良的蛋白飼料。本實驗通過微生物固態(tài)發(fā)酵的方法，選用兩種菌株發(fā)酵豆渣，目的在于在保留豆渣原有的優(yōu)質營養(yǎng)物質的基礎上，粗蛋白含量有所提高，改善了其不良氣味和適口性，并且最大程度的提高豆渣的貯存時間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

原料：豆渣(來自于黑龍江省哈爾濱市某豆制品廠)。

輔料：麩皮(購于黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學附近某飼料市場)。

1.1.2 試驗菌種

產(chǎn)朊假絲酵母（購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心菌種編號1769）經(jīng)過兩次活化；白地霉（中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心菌種編號1315）經(jīng)過兩次活化。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：用含水量80%左右的濕豆渣和麩皮按一定比例混合含水量在60%左右的培養(yǎng)基；

產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)基：酵母膏0.3%、麥芽浸膏0.3%、蛋白胨0.5%、葡萄糖1%，培養(yǎng)溫度26℃；

白地霉培養(yǎng)基：5°Bé麥芽汁，pH值自然，培養(yǎng)溫度28～30℃。

1.1.4 試驗儀器

FOSS凱氏定氮儀、ANKOM A200i型半自動纖維分析儀,超凈無菌操作臺、pH計、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、ZD-85氣浴恒溫振蕩器、高壓滅菌鍋、冰箱。

1.2 試驗設計

1.2.1 發(fā)酵菌株比例的確定

試驗設計兩菌株5組不同混合比例，產(chǎn)朊假絲酵母與白地霉的比例分別為0∶100、25∶75、50∶50、75∶25、100∶0。在28 ℃、發(fā)酵72 h，每個處理3個重復。分別測定其在0、24、48 h和72 h的活菌數(shù)，來確定其添加的最佳比例。

1.2.2 最佳接種時間的確定

根據(jù)繪制的兩種菌株的生長曲線，選擇菌種最為活躍的對數(shù)期來接入培養(yǎng)基進行發(fā)酵。繪制生長曲線方法見1.3.4節(jié)。

1.2.3 最佳滅菌方式的確定

設計滅菌方式分別為：①不滅菌；②高壓滅菌80℃、30 min；③高壓滅菌100℃、5 min；④高壓滅菌115℃、15 min。將擴大后的菌種以最佳混合比例10%的混合菌液添加比例接菌50 g發(fā)酵原料于250 ml錐形瓶中，于恒溫氣浴搖床以150 r/min、30℃培養(yǎng)48 h，通過測定其pH值來確定滅菌方式。

1.2.4 正交試驗設計篩選最佳發(fā)酵條件組合

采用產(chǎn)朊假絲酵母（1769）和白地霉（1315）在上述試驗中得到的最佳混合比例和接種時間接菌，最佳滅菌方式滅菌，同時發(fā)酵條件以A菌液添加量、B發(fā)酵原料含水量、C發(fā)酵溫度、D發(fā)酵時間為試驗因素，每個因素設定3個水平。以發(fā)酵產(chǎn)品的活菌數(shù)和pH值為評價指標，設計L9(34)正交試驗，試驗的因素水平見表1。

表1 正交試驗的因素水平設計

1.2.5 最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)成分與原料的比較

通過單因素試驗和正交試驗得到的最佳發(fā)酵條件，在此條件下，得到的發(fā)酵產(chǎn)物與發(fā)酵原料進行比較，在物料質地、pH值、粗蛋白水平等方面比較發(fā)酵前后的變化。

1.3 試驗方法

1.3.1 營養(yǎng)成分的測定方法

常規(guī)營養(yǎng)成分：方法詳見《飼料分析及飼料質量檢測技術》（楊勝，1993）；活菌數(shù)：平板計數(shù)法；可溶性碳水化合物：蒽酮比色法；pH值采用玻璃電極法。

1.3.2 菌株的擴大培養(yǎng)

產(chǎn)朊假絲酵母：將原種(凍干管)解凍至常溫接種于培養(yǎng)基上，于恒溫氣浴振蕩器150 r/min，28℃培養(yǎng)72 h。

白地霉：將原種（凍干管）解凍至常溫接種于培養(yǎng)基上，于恒溫氣浴振蕩器150 r/min，28℃培養(yǎng)72 h。

1.3.3 菌種間的兼容性試驗

產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)基：分別培養(yǎng)單一產(chǎn)朊假絲酵母菌液和產(chǎn)朊假絲酵母白地霉混合菌液，每個處理3個平行，培養(yǎng)72 h，觀察其生長情況并計數(shù)。

白地霉培養(yǎng)基：分別培養(yǎng)單一白地霉菌液和白地霉與產(chǎn)朊假絲酵母混合菌液，每個處理3個平行，培養(yǎng)72 h，觀察其生長情況并計數(shù)。

1.3.4 兩種菌株生長曲線的繪制

將已經(jīng)活化的菌液繼續(xù)擴大培養(yǎng)，從0 h開始，每2 h用10 ml離心管取樣，用分光光度計于560 nm波長處測其吸光度值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制的曲線，即該菌株的生長曲線。以不接菌的培養(yǎng)基為空白調零，每個處理3個重復。

2 結果

2.1 發(fā)酵原料的營養(yǎng)成分測定

原料和發(fā)酵原料的常規(guī)營養(yǎng)成分如表2所示。

表2 原料和發(fā)酵原料的常規(guī)營養(yǎng)成分

2.2 菌種間的兼容性

①在相同的培養(yǎng)基上，分別培養(yǎng)單一產(chǎn)朊假絲酵母菌液和產(chǎn)朊假絲酵母白地霉混合菌液72 h，通過平板計數(shù)法觀察其生長狀況發(fā)現(xiàn)，與白地霉混合培養(yǎng)不影響產(chǎn)朊假絲酵母的生長。

②在相同的培養(yǎng)基上，分別培養(yǎng)單一白地霉菌液和白地霉產(chǎn)朊假絲酵母混合菌液72 h，通過平板計數(shù)法觀察其生長狀況發(fā)現(xiàn)，與產(chǎn)朊假絲酵母混合培養(yǎng)不影響白地霉的生長。

2.3 兩種菌株生長曲線的繪制、最佳接種時間的確定

2.3.1 產(chǎn)朊假絲酵母的生長曲線

產(chǎn)朊假絲酵母的生長曲線見圖1，由圖1可以看出，在開始發(fā)酵到第8 h之前，微生物處于對數(shù)期，生長比較迅速，微生物活力最旺盛。而在8 h以后達到一個相對穩(wěn)定的平臺期。通過試驗驗證，在發(fā)酵后8 h之前，選擇接種時間在二次活化后的第5 h，使其活力最旺盛，達到最好的發(fā)酵效果。

圖1 產(chǎn)朊假絲酵母的生長曲線

2.3.2 白地霉的生長曲線

由白地霉的生長曲線圖2可以看出，在0～16 h，微生物處在一個競爭期，生長情況不穩(wěn)定。在16～40 h，微生物處于對數(shù)期，此時的活力最旺盛。而在40 h以后達到一個相對穩(wěn)定的平臺期。通過多次試驗驗證，在16～40 h這一范圍內，選擇接種時間應在二次活化后的第24 h，使其活力最旺盛，可以達到最好的發(fā)酵效果。

圖2 白地霉的生長曲線

2.4 兩種菌株添加的最適比例（見表3）

表3 兩種菌株以不同比例發(fā)酵的活菌數(shù)[log(cfu/g)]隨時間的變化

由表3可以看出，單一菌種發(fā)酵的效果沒有混合發(fā)酵的活菌數(shù)量高，效果不如混合菌發(fā)酵的效果好，而從混菌發(fā)酵的三種不同比例發(fā)酵可以看出，在發(fā)酵24 h以后,混合比例為75∶25的發(fā)酵產(chǎn)物的活菌數(shù)明顯高于其他兩組，且差異顯著(P＜0.05)，所以當白地霉與產(chǎn)朊假絲酵母的混合比例為75∶25時，發(fā)酵基質中活菌數(shù)最多，發(fā)酵效果最佳。

2.5 最佳滅菌方式的確定

固體發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵之前要對發(fā)酵基質進行滅菌處理，設計4個滅菌處理：A為不滅菌（生料）；B為80℃、30 min；C為100℃、5 min；D為115℃、15 min(高溫滅菌)。通過對其發(fā)酵48 h的pH值和經(jīng)濟成本方面的因素綜合衡量來確定最佳滅菌方式。這4種方式對發(fā)酵產(chǎn)物的pH值影響見圖3。由圖3可知，在不做滅菌處理的條件下，發(fā)酵底物的pH值在7左右，這種環(huán)境不適宜抑制雜菌生長，容易導致發(fā)酵失敗，而其余三種滅菌方式，發(fā)酵底物的pH值均在5左右，適宜發(fā)酵并且能抑制其他不良雜菌生長繁殖，綜合經(jīng)濟成本的因素衡量，選擇C滅菌方式，即100℃下滅菌5 min即可。

圖3 不同滅菌方式發(fā)酵48 h后的產(chǎn)物pH值

2.6 正交試驗結果分析

以豆渣為原料，麩皮為輔料，選定兩菌的接種比例為75∶25，并且選擇了滅菌方式為100℃，滅菌時間為5 min，按照正交試驗設計的因素水平試驗，測定各因素水平下的活菌數(shù)值和pH值，并計算出不同處理標準水平之和k和極差值r，表4是正交試驗的設計及結果，由試驗結果比較其對活菌數(shù)和pH值兩項指標的影響并結合其因素的影響主次程度，得到最佳的發(fā)酵條件為A3B3C2D3。即接菌量為15%，發(fā)酵原料含水量為70%，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為72 h。

2.7 發(fā)酵前后產(chǎn)物的部分營養(yǎng)參數(shù)的變化

在正交試驗篩選出的發(fā)酵條件下，發(fā)酵產(chǎn)物較發(fā)酵原料的營養(yǎng)參數(shù)有了變化，營養(yǎng)參數(shù)以及發(fā)酵前后的變化情況見表5。通過試驗得到的最佳發(fā)酵條件下進行產(chǎn)朊假絲酵母和白地霉混合固態(tài)發(fā)酵豆渣，產(chǎn)物在保留了原有的營養(yǎng)成分的基礎上，粗蛋白提高了7～8個百分點，發(fā)酵產(chǎn)物由原來的豆腥味產(chǎn)生發(fā)酵香味，并且質地較原來更為疏松易散。產(chǎn)物的pH值明顯降低，這種酸性環(huán)境下更有利于抑制雜菌的生長，提高了貯存時間。

表4 正交試驗設計及結果

表5 發(fā)酵前后部分營養(yǎng)參數(shù)的比較

3 分析與討論

3.1 菌種的生長情況及接種時間的確定

通過菌種間的兼容性試驗已經(jīng)證明，產(chǎn)朊假絲酵母和白地霉之間混合不影響彼此的生長狀況，且兩種菌株的最佳培養(yǎng)溫度基本一致，通過比濁法繪制微生物的生長曲線是以不同時間菌液在560 nm處的OD值為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標繪制的。一般來說，微生物生長曲線分為遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。微生物處在對數(shù)期時生長速度最快，代謝旺盛、酶系活躍、活菌數(shù)和總菌數(shù)大致一致，選擇此時期將菌株接入培養(yǎng)基，能達到最優(yōu)的發(fā)酵效果，通過曲線確定產(chǎn)朊假絲酵母對數(shù)期為開始發(fā)酵的8 h之前，而白地霉的對數(shù)期處于16～40 h。最后確定了兩菌種的最佳接菌時間為產(chǎn)朊假絲酵母為二次活化后的第5 h，白地霉為第24 h。

3.2 最佳接菌比例的確定

在發(fā)酵過程中，由于兩種菌株是互利共生的關系，混菌發(fā)酵效果明顯高于單菌發(fā)酵效果，在滅菌良好的情況下，不同時間點取樣測定其活菌數(shù)是衡量發(fā)酵效果好壞的重要指標，試驗通過不同時間點的活菌數(shù)指標確定了最佳的發(fā)酵比例，即產(chǎn)朊假絲酵母和白地霉的混合比例為75∶25。

3.3 滅菌方式的確定

pH值是衡量發(fā)酵產(chǎn)物好壞的重要條件，不滅菌的處理，pH值比較高，這種接近中性的壞境，有害微生物不會受到抑制，導致發(fā)酵產(chǎn)物容易腐敗變質。而其他三種滅菌方式48 h的pH值差異不顯著，均處于pH值為5左右的酸性環(huán)境中，這種環(huán)境有利于抑制雜菌的生長，并且綜合經(jīng)濟成本的因素考慮，選擇滅菌方式為100℃，滅菌5 min即可。

3.4 正交試驗因素水平的確定

3.4.1 接種量

接種量是影響發(fā)酵效果的重要因素指標，接種量主要通過影響微生物生長速度來影響生命周期，接種量過大或者過小，都會對發(fā)酵產(chǎn)生影響，接種量過大會由于微生物數(shù)量過多產(chǎn)生過多的代謝廢物，而且會導致溶氧不足，因此要選擇最合適的接種量是發(fā)酵的關鍵，由試驗結果比較其對活菌數(shù)和pH值兩項指標的影響，選取A3為該因素的最佳水平，即最適宜的接種量為15%。

3.4.2 發(fā)酵原料的含水量

水分是對固態(tài)發(fā)酵影響比較大的因素之一，水分含量較低時，對于發(fā)酵底物營養(yǎng)成分的溶解性能和底物顆粒的膨脹指數(shù)均較低，導致試驗效果不理想，而水分如果過高，則會抑制氧氣的流通和傳遞，致使微生物生長情況變差，發(fā)酵不理想，所以應對發(fā)酵基質的含水量進行最適宜的選擇。由試驗結果比較其對活菌數(shù)和pH值兩項指標的影響，選取B3為該因素的最佳水平，即發(fā)酵原料含水量為70%。

3.4.3 發(fā)酵溫度

由于每種微生物的最優(yōu)培養(yǎng)溫度都不一樣，所以要嚴格控制溫度，只有在最適宜的溫度下，菌種才能達到最佳的生長狀態(tài)，而且在發(fā)育旺盛的時期，還會產(chǎn)生熱量，由試驗結果比較其對活菌數(shù)和pH值兩項指標的影響，選取C2為該因素的最佳水平，即發(fā)酵溫度為30℃。

3.4.4 發(fā)酵時間

發(fā)酵時間作為一個重要的發(fā)酵指標對發(fā)酵結果的好壞有非常重要的影響，發(fā)酵時間與發(fā)酵選用的菌種培養(yǎng)時間關系密切，而由于兩種菌株的交互作用有關，發(fā)酵時間過短，導致發(fā)酵不完全，營養(yǎng)物質沒有被微生物最優(yōu)的利用，而發(fā)酵時間過長，會使大量處于衰亡期的微生物代謝廢物的堆積，隨時間增加，菌體細胞增長緩慢，發(fā)酵后期培養(yǎng)基的營養(yǎng)不足導致菌體生長受到抑制。同時時間越長，發(fā)酵基質染菌的可能性就會增加。由試驗結果比較其對活菌數(shù)和pH值兩項指標的影響，選取D3為該因素的最佳水平，即最佳發(fā)酵時間為72 h。

3.5 發(fā)酵后部分營養(yǎng)參數(shù)的變化

通過試驗得到的最佳發(fā)酵條件下進行產(chǎn)朊假絲酵母和白地霉混合固態(tài)發(fā)酵豆渣，產(chǎn)物在保留了原有的營養(yǎng)成分的基礎上，粗蛋白提高了7～8個百分點，發(fā)酵產(chǎn)物由原來的豆腥味產(chǎn)生發(fā)酵香味，并且質地較原來更為疏松易散。產(chǎn)物的pH值明顯降低，這種酸性環(huán)境下更有利于抑制雜菌的生長，貯存時間得到了提高。

4 結論

本試驗采用產(chǎn)朊假絲酵母和白地霉混合固態(tài)發(fā)酵豆渣，對發(fā)酵菌種以及發(fā)酵方式進行了初步研究。并通過正交試驗篩選出了最優(yōu)的發(fā)酵條件組合為：接菌量為15%，發(fā)酵原料含水量為70%，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為72 h。在最佳條件下的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物在保留了原料有益營養(yǎng)物質的基礎上，使粗蛋白含量提高了7～8個百分點；改善了豆渣的氣味和適口性；通過發(fā)酵降低了豆渣的pH值，從而延長了貯存時間。