高廣勇 馬云明 岑建農(nóng)

（1.蘇州工業(yè)園區(qū)婁葑醫(yī)院普外科 江蘇 蘇州 215000；2.江蘇省血液研究所 江蘇 蘇州 215000）

核受體（Nuclear Receptors）是編碼轉錄因子的一個超基因家族，在調(diào)節(jié)人體內(nèi)多種生理活動中起到重要的作用。肝臟X受體(liver X receptor,LXR)和膽汁酸受體(Farnesoid X receptor,FXR)屬于核受體超基因家族[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，LXR和FXR在進行膽汁酸-膽固醇代謝的過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。為了探討膽囊膽固醇結石的形成與肝臟核受體基因表達水平的相關性，我們對近年來我院收治的18例膽囊膽固醇結石患者和同時在我院接受肝臟血管瘤切除術且未患有膽結石的13 例患者的臨床資料進行回顧性研究?，F(xiàn)將研究結果報告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究的對象為近年來我院收治的18例膽囊膽固醇結石患者和同時在我院接受肝臟血管瘤切除術且未患有膽結石的13例患者。將18例膽囊膽固 醇結石患者作為實驗組，將接受肝臟血管瘤切除術且未患有膽結石的13 例患者作為對照組。在實驗組患者中，有男性患者6 例，女性患者12 例。他們的平均年齡為（39.44±5.61）歲。他們均接受了膽囊切除術，經(jīng)術后病理檢查均被確診患有膽固醇結石。在對照組患者中，有男性患者5 例，女性患者8 例。他們的平均年齡為（37.77±5.21）歲。他們均因患有肝臟血管瘤而接受了肝臟血管瘤切除術。他們經(jīng)術前影像學檢查及術中探查均被確診未患有膽結石。兩組患者在性別、年齡等一般資料方面相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 檢測方法

1.2.1 進行總RNA提取和合成cDNA 在對兩組患者進行相關的手術后，在其肝臟的邊緣切取其肝組織。切取肝組織的體積約為0.5 g。將切取下來的肝臟組織立即置于液氮中進行凍存，再將其轉移至－70℃的冰箱中進行保存以備用。使用TRIzol （由INVITROGEN公司生產(chǎn)）的試劑對患者切取下來的肝臟組織中的總RNA進行提取。在使用DEPC-H2O 將總 RNA 稀釋到 0.5μg/μl后， 采用 M-MVL逆轉錄酶（由PROMEGA公司生產(chǎn)）試劑合成cDNA。

1.2.2 進行實時定量PCR 進行實時定量PCR檢測使用的引物是由Primer Express 軟件5.0（由美國Applied Biosystem公司生產(chǎn)）所設計的，并由上海生工公司進行合成。PCR反應體系包含：cDNA為200 ng， Eavgreen為1 μl，引物的濃度為200pM,在加入雙蒸水后使引物的體積達到25 μl。對樣品進行3個重復的PCR反應。使用定量PCR儀（由MJ公司生產(chǎn)）對樣品進行PCR 反應。進行PCR 反應的條件是:當溫度達到95℃5 min后對樣品進行50個循環(huán)，進行PCR 反應的閾值為0.05。進行每1個循環(huán)的過程是：在溫度為95℃時進行變性反應20s。在溫度為58℃時退火20s。在溫度為72℃時進行延伸操作20秒，在溫度為78℃時進行讀板。在實時定量進行PCR反應檢測結束后，使用熔解曲線對PCR 產(chǎn)物的特異性進行檢驗。 當熔解曲線的溫度從60℃上至96℃的過程中，每上升0.2度進行一次讀板。將PCR產(chǎn)物放置在瓊脂糖凝膠電泳中，通過對PCR產(chǎn)物條帶進行觀察以檢驗PCR產(chǎn)物的特異性,并確定其不存在基因組DNA擴增的現(xiàn)象。由PCR反應的標準曲線獲得Ct值，然后計算基因表達的相對量。采用GDPAH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）作為內(nèi)參照。計算公式為：ΔC（t）=C（t）目的基因 -C(t)GDPAH， 基因表達的相對量 =2-ΔC（t）×10000。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 11.0統(tǒng)計學軟件(由美國SPSS 公司生產(chǎn))對本研究中的數(shù)據(jù)進行處理，計量資料用均數(shù)正負標準差（±s）表示,組間比較采用非參數(shù)檢驗（Mann-Whitney），P＜0.05表示組間差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

實驗組患者的LXRα、FXR和SHP等基因mRNA的表達水平均明顯高于對照組患者，二者相比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組患者的 LXRβ基因及LRH-1基因 mRNA的表達水平相比較，差異無統(tǒng)計學意義（p＞0.05）。詳情見表1。

表 1兩組患者肝臟核受體基因mRNA表達水平的比較

3 討論

LXR和FXR可通過調(diào)控靶基因的表達以維持脂類代謝的平衡。ABCB11和ABCB4都是FXR的靶基因[2]。ABCG5和ABCG8都是LXR的靶基因。有研究證實，ABCB11、ABCB4 、ABCG5和ABCG8的表達水平與膽結石的形成密切相關[3，4]。ABCG5和ABCG8[5]都是位于肝細胞膽管側膜的轉運蛋白，其在肝細胞分泌膽汁的過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。相關的研究結果顯示，初級膽汁酸鵝脫氧膽酸(CDCA)和膽酸(CA)均可與FXR的LBD相結合，從而可調(diào)控靶基因的表達[6]。FXR被稱為膽汁酸感受器，可維持膽汁酸內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。FXR在膽汁酸代謝的過程中可通過3條途徑發(fā)揮作用:①通過I-BABP（回腸脂肪酸結合蛋白）調(diào)控小腸對膽汁酸的攝取量。②通過調(diào)控ABCB11（BSEP蛋白）和ABCB4的表達，以促進膽汁酸和磷脂向膽道分泌。③通過調(diào)控CYP7A1的活性，以抑制膽固醇合成膽汁酸。CYP7A1是由膽固醇轉化為膽汁酸途徑中的限速酶。FXR需通過核受體SHP( short heterodimerpartner)和核受體LRH-1(liver receptor homolog-1) 對CYP7A1的活性進行調(diào)節(jié)[7]，從而調(diào)控膽汁酸的合成。

總之，膽囊膽固醇結石的形成與肝臟核受體基因mRNA的表達水平密切相關。因此，臨床上可將上述指標作為膽囊膽固醇結石患者進行診治的參考依據(jù)。

[1] 王水良.核受體的研究進展.遺傳學報.2004；31：420－429

[2] 秦儉.核受體LXR和FXR對脂類代謝的調(diào)節(jié). 國外醫(yī)學外科學分冊，2005；32：223－226

[3] 蔣兆彥，韓天權，所廣軍.膽固醇結石病人肝臟膽小管側膜ATP基因表達差異的研究.外科理論與實踐，2005;10（1）：61－65

[4] 高廣勇，郭呂，岑建農(nóng).膽囊膽固醇性結石病人肝臟ABC基因表達研究.中華肝膽外科雜志，2008，14（4）：281－283

[5] Edwards PA, Kast HR, Anisfeld AM. BAREing it all: the ad option of LXR and F XR and their roles in lipid home ostasis.J Lipid Res, 2 0 02,4 3(1):2-12.

[6] Makishima M, Okamoto AY, Repa JJ, et al. Identification of a nuclear receptor for bile acids.S cience,1 999,2 84( 54 18) :1362-13 65 .

[7] SeolW ,C hungM ,M ooreD D.Novel receptor interaction and repression domains in the orphan receptor SHP.Mol C ell Biol,1 997, 17( 12 ): 7126-7131.