蟒蛇活性寡肽的分離及其抗氧化活性研究

高穎，高曉晨，姜威，鮑悅，張輝*，孫佳明*

(長春中醫(yī)藥大學,長春 130117)

摘要：目的對蟒蛇活性寡肽分離及純化，并對單體寡肽進行抗氧化活性研究。方法以蟒蛇活性肽為原料，采用Sephadex LH-20凝膠柱色譜法，反相硅膠C8柱色譜法，ODS-C18高效液相制備柱色譜法進行分離純化，得到蟒蛇單體寡肽，以羥基自由基清除率作為評價指標，對蟒蛇單體寡肽進行抗氧化性能考察。結果得到蟒蛇單體寡肽MS-A和MS-B，測得MS-A的清除羥基自由基的IC50值為6.52 mg/mL，MS-B的清除羥基自由基的IC50值為8.39 mg/mL，同法測得Vc的IC50值為0.35 mg/mL。結論蟒蛇單體寡肽具有良好的抗氧化活性。

關鍵詞：蟒蛇活性肽；分離；抗氧化

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.11.020

中圖分類號：R282文獻標志碼： A

基金項目：吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目(吉教科合字[2012]第77號)。

作者簡介：高穎(1974-)，女，碩士研究生導師，主要從事中藥與天然藥物化學研究。

收稿日期:(責任編輯：張瑞彬2015-10-10)

*通信作者：張輝,電話-(0431)86172080,電子信箱- zhanghui-8080@163.com;

孫佳明,電話-(0431)86172280, 電子信箱-sun_jiaming2000@163.com

Separation and antioxidant activity of oligopeptides from python

GAO Ying, GAO Xiaochen, JIANG Wei, BAO Yue, ZHANG Hui*, SUN Jiaming*

(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Abstract：ObjectiveTo separate and purify the python active oligopeptide, and to research the antioxidant activity of single peptide. MethodsWith the python active peptide as raw material, Sephadex LH-20 chromatography, reversed phase C8 column chromatography, ODS-C18 HPLC column chromatography were used to separate and purify, obtain the python oligopeptide, the hydroxyl radical scavenging rate as the evaluation index, investigate the python oligopeptide of the antioxidant properties. ResultsObtained the python oligopeptide MS-A and MS-B, MS-A of scavenging hydroxyl free radical of the IC50 values was measured is 6.52mg/ml, the IC50 values of MS-B is 8.39mg/ml. With the IC50 values of Vc is 0.35 mg/mL. ConclusionPython peptide has good antioxidant activity.

Keywords：python active peptide; separation; antioxidation

蟒蛇是當今世界上最原始的優(yōu)質蛇種之一，具有一般蛇類不可比擬的經(jīng)濟價值、營養(yǎng)價值和藥用價值。蟒蛇入藥最早記載于南北朝《名醫(yī)別錄》，在《本草綱目》中也被收載于蛇膽項下，其中記載蚺蛇膽，味甘、苦、寒，有小毒。主心痛，下腹瘡，目腫痛。蟒蛇肉具有祛風活絡，殺蟲止癢的功效，多被用于風痹癱瘓，疥癬惡瘡等證的治療。同時也是一種營養(yǎng)價值很高的食物，具有舒筋活絡、滋補身體之功效[1-4]。近年來，未見對蟒蛇活性寡肽的分離及其抗氧化活性的相關報道，這無疑阻礙了蟒蛇資源的進一步開發(fā)和利用。因此，為了更好的應用蟒蛇動物藥資源，有必要對蟒蛇活性寡肽進行深入研究[5]。

1材料與儀器

蟒蛇蛇肉蛋白質酶解生物活性肽由長春中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心自制。甲醇等試劑均為分析純。DBS-160電腦全自動部份收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)，Sephadex LH-20(GE Healthcare Bio-Sciences AB)，反相硅膠中壓柱(Sciences-AB)，高效液相色譜儀(Agilent 1100)，十萬分之一電子天平(BP211D)(德國賽多利斯天平有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(江蘇南通縣通海電器廠)。

2方法與結果

2.1蟒蛇活性肽的分離、純化

2.1.1 Sephadex LH-20凝膠柱色譜法分離活性肽取蟒蛇酶解肽凍干粉50 mg，加水溶解，過0.45 μm水膜，將濾液上Sephadex LH-20凝膠柱，用蒸餾水洗脫，得到100個流分。根據(jù)紫外檢測器在220 nm處的吸光值制定蟒蛇酶解肽的洗脫分布圖，見圖1。

圖1　蟒蛇酶解肽的Sephadex LH-20色譜圖

從圖上可以看出流分Fr.13～Fr.22和Fr.34～Fr.52的為主要色譜峰，合并，凍干，分別命名為MS-01和MS-02。

2.1.2反相硅膠C8柱色譜法純化MS-01和MS-02將從凝膠柱分離下來命名為MS-01和MS-02的凍干粉，用10%的甲醇-水系統(tǒng)溶解過膜，分別上C8反相柱，洗脫，自動流分收集器收集，波長220 nm，流速3，自動接樣流分5 mL/管。

MS-01經(jīng)分離收集流分Fr5～12，經(jīng)薄層色譜檢視，具有相同顏色和Rf值斑點的流分合并，命名為MS-01-A。

MS-02經(jīng)分離收集流分Fr16～24，經(jīng)薄層色譜檢視，具有相同顏色和Rf值斑點的流分合并，命名為MS-02-A。

2.1.3ODS-C18高效液相制備柱色譜法制備單體寡肽將ODS-C8中壓制備柱層析洗脫流分MS-01-A和MS-02-A進行ODS-C18高效液相制備柱層析。采用制備柱Venusil ASB C18(5 μm 150? 10 mm×150 mm)，15%MeOH(1‰甲酸)等度洗脫，檢測波長220 nm，流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃。結果見圖2、圖3。經(jīng)過高效液相色譜反復制備，最后得到單體化合物MS-A和MS-B。MS-A和MS-B經(jīng)上述色譜條件，更換分析柱Venusil ASB C18(5 μm 150? 4.6 mm×250 mm)進行純度檢測，面積歸一化法顯示二者純度分別為97%和95%。

2.2單體寡肽MS-A、MS-B羥基自由基清除活性的測定

2.2.1羥基自由基清除活性的測定采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[6]。取0.80 mmol/L鄰二氮菲1 mL于試管中依次加入2 mLPBS(0.2 mol/L,pH7.37)和1mL蒸餾水，充分混勻后，加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵(FeSO4·7 H2O)1 mL，混勻后，加入0.01%雙氧水(H2O2)1 mL，于37 ℃水浴60 min，在510 nm測其吸光度值，所測得的數(shù)據(jù)為損傷管的吸光度值A(損)。未損傷管以1 mL蒸餾水代替損傷管中的1 mL0.01%的雙氧水(H2O2)，操作方法同損傷管，可測得510 nm未損傷管的吸光度值A(未)。樣品管以已經(jīng)補足至1 mL的樣品代替損傷管中的1 mL蒸餾水，操作方法同損傷管，可測得510 nm樣品管的吸光度值A(樣)。各樣品管中加入的溶劑如下：

A(損)：鄰(1 mL)+PBS(2 mL)+H2O(1mL)+ FeSO4·7 H2O(1 mL)+ H2O2(1 mL)

A(未)：鄰(1 mL)+PBS(2 mL)+H2O(1mL)+ FeSO4·7 H2O(1 mL)+ H2O(1 mL)

A(樣)：鄰(1 mL)+PBS(2 mL)+樣品(1 mL)+ FeSO4·7 H2O(1 mL)+ H2O2(1 mL)

根據(jù)如下公式進行數(shù)據(jù)處理：

羥基自由基清除率D(%)=[A(樣)-A(損)] /[A(未)-A(損)]×100%

2.2.2結果分析測定蟒蛇酶解肽單體MS-A、MS-B的羥基自由基清除率，結果見圖3、圖4。

經(jīng)測定得到蟒蛇活性寡肽MS-A的清除羥基自由基的IC50值為6.52 mg/mL，MS-B的清除羥基自由基的IC50值為8.39 mg/mL，同法測得Vc的IC50值為0.35 mg/mL。結果顯示，蟒蛇酶解肽化合物對·OH均有一定的清除能力，且與Vc對比,化合物MS-A、MS-B的抗氧化活性弱于Vc。

3結論

結果表明，蟒蛇單體寡肽MS-A、MS-B均具有較好的抗氧化活性。本文首次采用凝膠柱層析、反相硅膠C8柱層析及ODS-C18制備柱層析相結合的方法分離提取蟒蛇酶解肽，得到具有抗氧化功能的單體寡肽，為以蟒蛇酶解肽為原料的具有抗氧化功能保健食品的深入開發(fā)奠定基礎，進而可帶動蟒蛇養(yǎng)殖和深加工等產業(yè)化規(guī)模，創(chuàng)造更大的經(jīng)濟效益和社會效益。

圖2　MS-01-A高效液相色譜圖

圖3　MS-02-A高效液相色譜圖

圖4　蟒蛇酶解肽單體MS-A對羥自由基的清除能力

圖5　蟒蛇酶解肽單體MS-B對羥自由基的清除能力

參考文獻：

[1] CHEN H M,MURAMOTO K,YAMAUCHI F,et al.Antioxida-tive properties of histidine-containing peptides designed from peptide fragments found in the digests of a soybean protein[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998(46):49-53.

[2] CHEN J,SUETSUNA K,YAMAUCHI F.Isolation and characterization of immunostimulative peptides from soybean[J].Journal of Nutrition Biochemistry,1995(6):310-313.

[3] 賓冬梅,鐘福生.蛇肉的營養(yǎng)與粗加工[J].蛇志,2003(1):65-68.

[4] 高穎,孫佳明,張輝. 蟒蛇活性肽抗氧化作用的研究[J].吉林中醫(yī)藥,2012,32(11):1138-1139.

[5] 邵江娟,姚忠,吳昊,等.牡蠣抗氧化寡肽的提取分離研究[J].中藥材,2013,36(9):1395-1397.

[6] 杜丹,王晨,艾鳳偉,等.微波提取八角茴香揮發(fā)油的工藝及抗氧化活性研究[J].吉林中醫(yī)藥, 2011,31(5):466-468.