摘要：以雜合二倍體馬鈴薯（Solanum tuberosum）RH89-039-16 （RH）無菌植株為材料，利用控制變量法對植物生長素和細(xì)胞分裂素濃度進(jìn)行篩選以獲得再生體系所需激素配比。結(jié)果表明，葉片愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基激素濃度配比為ZT 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L；莖段愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基激素濃度配為比 ZT 0.5 mg/L+IAA 2.5 mg/L；愈傷組織分化不定芽的培養(yǎng)基激素濃度配比為ZT 2.0 mg/L+GA3 10 mg/L。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯（Solanum tuberosum）；愈傷組織；不定芽；分化；再生體系

中圖分類號：S532 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0493-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.058

馬鈴薯（Solanum tuberosum）為僅次于小麥、玉米的第三大糧食作物，是中國第四大主糧。目前，對馬鈴薯品種改良的研究主要集中在常規(guī)育種和基因工程育種等方面[3，4]。常規(guī)育種方法存在人力、物力、財(cái)力上消耗大、周期長等問題，自然界優(yōu)良的種質(zhì)難以被及時(shí)發(fā)現(xiàn)利用，因此某種程度上阻礙了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展。對馬鈴薯而言，還存在一些難以逾越的“生物學(xué)路障”，如馬鈴薯遺傳分離復(fù)雜，后代篩選繁瑣。基因工程育種是以分子育種以及分子育種與傳統(tǒng)育種相結(jié)合的方法來進(jìn)行作物育種的，這種相結(jié)合的方法有著更為突出的優(yōu)勢。隨著馬鈴薯基因組序列的公布，高效遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系和馬鈴薯EST數(shù)據(jù)庫的建立，為發(fā)掘馬鈴薯功能基因創(chuàng)造了十分有利的條件。在研究基因功能的過程中，首先要了解該基因在植物生長發(fā)育及代謝調(diào)控過程中所發(fā)揮功能與作用，因此在功能基因組的大規(guī)模挖掘和鑒定研究中，最重要和最直接研究手段就是創(chuàng)造各種飽和的突變體庫。本試驗(yàn)所采用的材料雜合二倍體馬鈴薯RH89-039-16（RH）的全基因組序列已經(jīng)由國際馬鈴薯基因組測序委員會(huì)（PGSC）測序完成，并已于2011年7月在《自然》雜志上公布了測序成果[1，2]。

目前，最直接且最主要的突變體庫創(chuàng)建方法為插入突變體庫的構(gòu)建，是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)將一段外源的DNA元件插入到基因序列中，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)破壞而引起突變，產(chǎn)生帶有該DNA序列標(biāo)簽的突變體，利用PCR和測序技術(shù)獲取插入突變位點(diǎn)序列信息[5，6]。但在利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)插入外源基因時(shí)，必須構(gòu)建該材料的再生體系。本試驗(yàn)初步篩選了適宜馬鈴薯RH的再生體系為后續(xù)將目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入馬鈴薯基因組，研究其基因功能打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試材料 采用生長15～20 d的馬鈴薯材料為雜合二倍體馬鈴薯RH89-039-16（RH）無菌試管苗。在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照14 h/d，采用日光燈補(bǔ)光。

1.1.2 試劑 所用植物生長調(diào)節(jié)劑IAA、NAA、2，4-D、6-BA、ZT、GA3以及試驗(yàn)用試劑為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

以前人的研究作為參考[7-15]，利用控制變量法對植物生長調(diào)節(jié)劑濃度進(jìn)行篩選。結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選用植物分裂素IAA、NAA、2，4-D和植物生長素ZT之間的配比來誘導(dǎo)愈傷組織；選用ZT、6-BA和GA3之間的配比來誘導(dǎo)愈傷組織不定芽分化。

1.2.1 RH莖段、葉片愈傷組織的誘導(dǎo) 選取在普通MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d左右的馬鈴薯RH無菌苗作為材料，將莖段切去生長點(diǎn)，每段約1 cm。將長勢良好的葉片分為3段，分別放入含有植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d，篩選愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.2 RH愈傷組織不定芽的分化 將得到的鮮綠色較為緊實(shí)的愈傷組織轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)分化不定芽的篩選培養(yǎng)基中，選用不同的ZT和6-BA以及ZT和GA3的配比，將愈傷組織培養(yǎng)20 d左右，觀察記錄不定芽發(fā)生率。

2 結(jié)果與分析

2.1 RH莖段、葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇

在對馬鈴薯RH愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選時(shí)，利用6-BA和KT和植物生長素進(jìn)行激素配比時(shí)，無法得到愈傷組織。本試驗(yàn)采用ZT和IAA、ZT和NAA、ZT和2，4-D的不同配比，分別對馬鈴薯莖段和葉片進(jìn)行愈傷發(fā)生研究。從表1～表3可知，分別利用細(xì)胞分裂素6-BA、KT和植物生長素的各種配比不利于雜合二倍體馬鈴薯RH愈傷組織的發(fā)生，而在利用更高效的ZT作為細(xì)胞分裂素時(shí)有很好的誘導(dǎo)作用。當(dāng)ZT濃度過低時(shí)，并不利于愈傷組織的形成，只有ZT和植物生長素配比較為接近時(shí)，才會(huì)產(chǎn)生較好的愈傷組織，尤其是ZT 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L、ZT 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L、ZT 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L時(shí)RH葉片愈傷發(fā)生率較高，且得到的愈傷形態(tài)較為致密；當(dāng)ZT 0.5 mg/L+IAA 2.5 mg/L、ZT 1.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L時(shí)RH莖段愈傷發(fā)生率較高，且得到的愈傷形態(tài)較為致密。圖1為得到較好愈傷組織培養(yǎng)基以及愈傷組織形態(tài)。

2.2 RH愈傷組織不定芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇

將得到的較好的愈傷組織進(jìn)行不定芽分化誘導(dǎo)，利用ZT和6-BA、ZT和GA3的配比，對愈傷組織分化不定芽的激素進(jìn)行篩選，結(jié)果見表4、表5。經(jīng)過20 d左右的培養(yǎng)，ZT 2 mg/L+GA3 10 mg/L分化培養(yǎng)基中分化出不定芽，尤其在由葉片 （ZT 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L）、莖段（ZT 0.5 mg/L+IAA 2.5 mg/L）誘導(dǎo)的愈傷組織分化不定芽效率最高。分化不定芽形態(tài)見圖2。

3 小結(jié)與討論

由于馬鈴薯對植物激素耐受性的特點(diǎn)，在對不同品種馬鈴薯進(jìn)行再生體系的研究顯得十分必要。在試驗(yàn)過程中，證明品種間的差異導(dǎo)致內(nèi)源激素的耐受性不一。本試驗(yàn)初步篩選出適宜馬鈴薯RH的再生體系，為后續(xù)開展的轉(zhuǎn)基因品種改良和基因功能的研究打下了一定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] VISSER R G F，BACHEM C W B， BOER J M d. et al. Sequencing the potato genome： Outline and first results to come from the elucidation of the sequence of the world’s third most important food crop[J]. American Journal of Potato Research， 2009， 86（6）：417-429

[2] 賀 俊，張忠華，李 穎，等.國際馬鈴薯和番茄基因組測序進(jìn)展[J].園藝學(xué)報(bào)，2008，35（10）：1545-1549.

[3] 金光輝.我國馬鈴薯育種方法的研究應(yīng)用現(xiàn)狀及其展望[J].中國馬鈴薯，2000（3）：184-186.

[4] 張俊蓮，王 蒂.我國馬鈴薯育種方式的變遷及其轉(zhuǎn)基因育種研究進(jìn)展[J].中國馬鈴薯，2005，19（3）：163-167.

[5] 蘇 紅，印莉萍.插入突變在水稻功能基因組學(xué)中的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2009（5）：1-4.

[6] 楊永智，路鐵剛.水稻大規(guī)模增強(qiáng)子捕獲系群體的創(chuàng)建與初步分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，2004.

[7] 石 虎，楊永智，周 云，等.馬鈴薯新品種青薯9號高效再生體系的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：14-19.

[8] 秦 敏，郜 剛.馬鈴薯再生體系的建立及其遺傳分析[J].中國馬鈴薯，2005，19（5）：270-272.

[9] 奇恩芳.馬鈴薯再生體系建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)AcInv反義基因轉(zhuǎn)化[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[10] 李 娟，程智慧，張國裕.馬鈴薯葉片高效再生體系的建立[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（4）：610-614.

[11] 張之為，趙 君，樊明壽，等.馬鈴薯不同品種葉片再生體系的建立[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011（1）：61-68.

[12] 崔海辰，董 磊，陶龍鑫，等.馬鈴薯再生體系的建立[J].內(nèi)蒙古大學(xué)藝術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33（4）：131-135.

[13] VISSER R G F，JACOBSEN E，HESSELING-MEINDERS A， et al. Transformation of homozygous diploid potato with an Agrobacterium tumefaciens binary vector system by adventitious shoot regeneration on leaf and stem segments[J].Plant Molecular Biology，1989，12（3）：329-337.

[14] 李 穎. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因體系的建立[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[15] 李 云，盧其能，趙昶靈，等.影響馬鈴薯再生體系建立的主要因素[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（28）：15487-15489.