摘要：從石斛內生菌變棲克雷伯菌（Klebsiella variicola）SH-1中PCR擴增得到吡咯喹啉醌（PQQ）基因，其大小為5 444 bp，包含了pqqABCDEF 6個基因，并對PQQ基因進行了生物信息學分析，為下一步構建高效基因工程菌，研究其生物合成途徑奠定了基礎。

關鍵詞：PQQ基因；變棲克雷伯菌；生物信息學分析

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0490-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.057

PQQ，學名為吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone），化學名稱為4，5-二氫-4，5-二氧化-1-氫吡咯（2，3f）醌-2，7，9-三羧酸，又名Methaxatin，是繼黃素核苷酸和煙酰胺核苷酸之后在細菌脫氫酶中發(fā)現(xiàn)的第三種輔基，世界醫(yī)學界稱之為第十四種維生素。從20世紀80年代開始，人們就開始對吡咯喹啉醌（PQQ）的生理生化進行了研究。PQQ作為醌蛋白的輔基，參與呼吸鏈電子傳遞，是一種具有多種生理功能的生物活性物質[1，2]。PQQ具有促進機體生長、防治肝損傷、促進神經生長因子生成、調節(jié)機體自由基水平（抗氧化）、提高機體免疫力以及增強細菌對毒性和輻射等極端條件的耐受性等功能，是一種獨特的生理活性物質[3，4]，是動物生長、發(fā)育和繁殖必需的營養(yǎng)因子[5]。目前，能夠以PQQ作為輔基的酶，包括有甲醇脫氫酶（MDH）、乙醇脫氫酶（EDH）、醇脫氫酶（ADH）、葡萄糖脫氫酶（GDH）、聚乙烯醇脫氫酶（PVDH）、奎尼酸脫氫酶（QDH）、果糖脫氫酶（FDH）、聚乙二醇脫氫酶（PGDH）、四氫糠醇脫氫酶（TDH）、山梨（糖）醇脫氫酶（SDH）和羽扇烷寧羥化酶（LUH）等[6]。已知能夠產生PQQ的微生物僅限于某些革蘭氏陰性細菌，目前尚未明確真核生物能否利用PQQ的醌酶，并且動物和植物本身無法合成PQQ，只是在植物、動物包括人體內以及多種食物中含有痕量的PQQ，含量與維生素K、生物素相當[7-9]。研究還發(fā)現(xiàn)，動物主要通過飲食途徑攝取PQQ[10]。有些細菌如大腸桿菌和沙門氏菌，自身不能合成PQQ，但能產生依賴PQQ的蛋白質（這種蛋白質稱為脫輔蛋白），在攝取外源PQQ時能形成有活性的全酶[11]。

PQQ不僅是某些微生物體內氧化還原酶的輔助因子，還是一種刺激生長代謝的營養(yǎng)因子。這種刺激主要表現(xiàn)在：①加快菌體的生長速度和生物產量，但不能縮短其遲緩期；②能顯著地縮短菌體生長的遲緩期，但對指數(shù)期的生長速度和靜止期生物產量沒有影響[6]。PQQ還能夠顯著增強微生物對極端環(huán)境的適應能力，促進植物生長、發(fā)育與繁殖，如縮短植物的花粉萌發(fā)時間、促進種子萌發(fā)、提高脂肪酶活性和種子呼吸速率。PQQ具有很好的電化學活性和較高的穩(wěn)定性，已經用于生物電極上[12]，PQQ的電化學研究不僅有助于研發(fā)新的擬生態(tài)催化系統(tǒng)，還有助于了解醌酶的催化機制。在構建的幾種細菌基因文庫中分別克隆到了與PQQ合成有關的基因，并經序列分析、轉錄及表達研究發(fā)現(xiàn)，PQQ的生物合成是一個由5～6步酶促反應組成的多步過程，合成過程可能涉4～7個相關基因：醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）[13]和氧化葡萄糖桿菌（Gluconobacter oxydans）[14]中的pqqABCDE、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）[15]中的pqqABCDEF和外鏈甲基桿菌（Methylobacterium extorquens）[16]中的pqqABCDEFG，并且這些基因往往是以基因簇的形式存在。

最近研究表明，PQQ也可以消除人體自由基，治療因自由基過多引發(fā)的胃腸疾病、心腦血管疾病、癌癥等，在抗衰老方面也起著重要的作用[17]。盡管如此，對于吡咯喹啉醌的分布狀況、產生機理、結構、功能和生物學性質還有待進一步研究。本研究利用特異性引物擴增并克隆得到PQQ基因，變棲克雷伯菌（K.variicola）的pqq位點的完整核苷酸序列也已經找到，并且構建了PQQ基因結構圖譜，對核苷酸序列比對結果和相關生物信息學分析進行了討論，為下一步構建PQQ高產菌株，研究PQQ生物合成以及進一步推動PQQ在食品、輕工、農業(yè)和醫(yī)藥等方面的應用具有重要的實踐意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株為石斛內生菌變棲克雷伯菌SH-1（專利號：ZL201310383464.0，菌株保藏號：CCTCC M 2013367）[18]。

1.2 DNA提取與目的基因的擴增

1.2.1 DNA的提取 采用CTAB/NaCl法提取細菌基因組DNA參考文獻[19]。

1.2.2 目的基因的擴增 以基因組DNA為模版，PCR擴增了目的基因。上游引物：5’-GCCTTCTAGAAGTTTTTTTCGCACTGTCG-3’；下游引物：5’-GACTAAGCTTGACAATAGCTGAATTCTCG-3’。PCR擴增體系為：10×Long PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，上、下游引物各1 μL，模板 2 μL，Long and Accurate Enzyme 0.25 μL，去離子水 39.75 μL，總體系50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.3 序列測定及生物信息學分析

PCR產物直接克隆到載體pGEM-T Easy vector （Promega公司），采用ABI PRISMTM 377 DNA 自動測序儀測定，序列分析采用SeqMan和MegAlign。

2 結果與分析

2.1 PCR產物序列分析

PCR擴增產物經電泳檢測，目的條帶大小約5.4 kb，對目的條帶進行克隆測序分析。結果表明，目的條帶與GenBank中的變棲克雷伯菌DSM 15968（登錄號為CP010523）PQQ基因相應片段序列核苷酸同源性高達98%，與變棲克雷伯菌DX120E（登錄號：CP009274）的相應片段序列核苷酸同源性達到97%，與變棲克雷伯菌At-22（登錄號：CP001891）相應片段序列核苷酸同源性達到97%（表1）。

2.2 PQQ基因生物信息學分析

5 444 bp的變棲克雷伯菌染色體DNA片段的分子質量為194 ku，由1 775 個氨基酸組成；pqqA基因大小72 bp，推測編碼由23個氨基酸組成的分子質量為2.8 ku的蛋白質；pqqB基因大小927 bp，推測編碼由307個氨基酸組成的分子質量為33 ku的蛋白質； pqqC基因大小750 bp，推測編碼由250個氨基酸組成的分子質量為27 ku的蛋白質；pqqD基因大小279 bp，推測編碼由93個氨基酸組成的分子質量為10 ku的蛋白質；pqqE基因大小1 130 bp，推測編碼由374個氨基酸組成的分子質量為41 ku的蛋白質； pqqF基因大小2 286 bp，推測編碼由753個氨基酸組成的分子質量為84 ku的蛋白質，結果與Meulenberg等[15]的研究結果大致相同，且pqqA與pqqB之間存在非編碼區(qū)，大小為54 bp。

2.3 PQQ結構基因圖譜

如圖1可以看出，5 444 bp的變棲克雷伯菌染色體DNA片段編碼的6個pqq基因。啟動子和轉錄的方向用箭頭表示（位于pqqA的上游）。pqqB與pqqC、pqqD與pqqE都有堿基重疊現(xiàn)象，分別有6 bp和13 bp重疊，本研究結果與Meulenberg等[15]研究的結果一致。

3 小結與討論

通過生物信息學分析6種PQQ操縱子的分子質量以及氨基酸數(shù)分別為pqqA（2.8 ku，23個氨基酸）、pqqB（33 ku，307 個氨基酸）、pqqC （27 ku，250個氨基酸）、pqqD（10 ku，93個氨基酸）、pqqE（41 ku，374個氨基酸） 和pqqF（84 ku，753個氨基酸）。不同來源的pqq基因都各自組成類似的pqq操縱元，但大部分基因之間具有氨基酸序列同源性。簇基因A編碼一個由22～39個氨基酸組成的小肽[20]，此小肽可能是PQQ的前體，并具有Glu-Val-Thr-X-Tyr的保守序列[21]，已有試驗證明在該段多肽上的谷氨酸和酪氨酸殘基是必需的[22]；簇基因B涉及PQQ跨膜轉運，即通過修飾某種已經存在的轉運體系實現(xiàn)PQQ的轉運；簇基因C是催化PQQ生物合成反應最后一步的酶；簇基因D功能研究結果繁多，但在M.extorquens AM 1中簇基因C和D是以融合基因形式存在的，二者是一個復合體；簇基因E可能涉及PQQ生物合成中某種酶的輔因子的合成；簇基因F和G可能負責小肽的加工。

通過序列比對發(fā)現(xiàn)，pqqF與大腸桿菌蛋白酶Ⅲ和人胰島素降解酶都具有一定的同源性，N端區(qū)域與線粒體蛋白酶亞基具有同源性[23]。菌體中其他一些類似pqqF的蛋白酶可以在一定程度上代替pqqF，在PQQ合成中發(fā)揮相同作用[24，25]。也有相關報道推斷pqqF可能是起到內切酶的作用，在PQQ合成的某個階段，當2個前體完成環(huán)合后將其從pqqA前體上切離下來[15]，也就是說pqqF參與基質（由pqqA編碼）中的肽鍵的斷裂，從而釋放PQQ。

已有學者從研究PQQ的生物合成基因及調控機理入手，運用基因工程方法，對PQQ基因的克隆、表達以及定向化可以改變原始菌株的遺傳性狀，進而構建出“超級菌株”，這可能是提高產業(yè)化生產PQQ發(fā)酵水平的一個重要途徑。雖然目前對PQQ生物合成途徑已經有了一定的認識，但對PQQ生物合成途徑及某些PQQ合成基因的功能尚不清楚，如pqqE、pqqF以pqqG的確切功能需要加以研究，PQQ合成的調控機制尚未闡明，PQQ合成基因之間的協(xié)調作用、PQQ合成與醌酶表達的關系、外部因素影響PQQ生物合成的機制等問題需要深入探討。此外，是否還存在其他PQQ基因，基因的確切功能將是下一步研究的重點和突破口之一。當PQQ生物合成基因搞清楚之時，構建高產PQQ工程菌就有了可能，PQQ產量就會大大提高，此物質在實踐中的應用研究也會得到廣泛地開展。

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