摘要：采用大孔樹脂純化野牡丹（Melastoma candidum D.Don）提取液中總黃酮，并對純化工藝進行優(yōu)化。以總黃酮回收率、總黃酮純度為指標，在單因素試驗的基礎上采用星點設計-效應面法考察了樣品液pH、上柱體積和乙醇洗脫體積分數(shù)對純化工藝的影響。結果表明，采用SP-70樹脂純化野牡丹提取液總黃酮的優(yōu)化工藝條件為上樣液濃度2～3 g/L，pH 5.45，上樣量為42.1 mL，吸附速率為2 BV/h，吸附完全后先以3 BV水洗去雜質，再用5 BV 68%的乙醇以3 BV/h的速率進行洗脫。SP-70樹脂在所確定的工藝條件下能較好地吸附野牡丹提取液中總黃酮，總黃酮回收率為85.38%，純度為54.68%，優(yōu)化后的純化工藝穩(wěn)定。

關鍵詞：野牡丹（Melastoma candidum D.Don）；星點設計；總黃酮；純化；大孔樹脂

中圖分類號：S685.99；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0456-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.049

野牡丹（Melastoma candidum D.Don）是野牡丹科野牡丹屬植物，在華南地區(qū)廣泛存在[1]，其活性成分為多糖、黃酮類、氨基酸、酚類等，臨床多用于清熱解毒、利濕消腫等功效，主治腸炎、痢疾等疾病[2]。從野牡丹中分離得到的槲皮苷、異槲皮苷、槲皮素、蘆丁等均為黃酮類化合物，具有清除自由基活性，可作為抗氧化新資源物質進一步開發(fā)利用[3，4]。大孔吸附樹脂通過物理作用選擇性地吸附植物初提液中的活性部分，去除無效雜質，實現(xiàn)分離純化[5，6]。近年來，有較多文獻報道采用大孔樹脂優(yōu)化含黃酮類植物組分的提取和分離純化工藝[7，8]。星點設計屬多因素5水平的試驗設計，模型的預測性好，并可通過三維效應面直觀分析最優(yōu)條件[9]。但關于星點設計用于黃酮類物質的提取純化文獻報道較少[10]。野牡丹資源豐富，為了有效開發(fā)和利用該植物資源，本試驗采用大孔樹脂吸附技術結合星點設計法對野牡丹提取液中總黃酮的純化工藝進行研究，旨在為進一步開發(fā)利用野牡丹植物資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野牡丹藥材（廣東南國藥業(yè)有限公司提供）。AB-8、NKA-9、SP-70樹脂（天津市光復精細化工研究所），D101樹脂（北京鵬林生物技術有限公司），HPD300、HPD600樹脂（河北滄州寶恩化工有限公司），蘆丁標準品（成都曼思特生物科技有限公司），乙醇、亞硝酸鈉、三氯化鋁、甲醇等試劑均為分析純。

UV757CRT型紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；PHS-3C酸度計（上海佑科儀器公司）；電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 野牡丹提取液的制備 稱取50 g經烘干粉碎的野牡丹藥材粗粉，按料液比1∶5（g∶mL，下同）加入95%的乙醇，水浴加熱回流1 h后，過濾，收集濾渣；取濾渣按料液比1∶10加入50%乙醇浸提過夜后超聲波提取1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮得野牡丹提取液，吸取野牡丹提取液適量，采用硝酸鋁顯色法測定吸光度[11]，計算野牡丹提取液濃度。

1.2.2 樹脂的選擇 選擇AB-8、D101、HPD300、HPD600、NKA-9和SP-70等6種樹脂用于純化野牡丹提取液。取適量的已知濃度的野牡丹初提液與大孔樹脂以相同流速進行動態(tài)吸附，充分吸附后的樹脂采用90%乙醇以相同的流速進行洗脫，收集洗脫液，比較不同樹脂的比吸附量、解吸率來選擇合適的樹脂。

1.2.3 單因素試驗考察大孔樹脂的吸附條件 設置單因素試驗考察樣品液濃度、樣品液pH、吸附流速和上樣量對大孔樹脂吸附的影響，樣品液通過樹脂柱進行動態(tài)吸附后，以水洗至無色后用90%乙醇解吸，收集解吸液，測吸光度，計算總黃酮回收率。①樣品液濃度。分別取濃度為1.21、1.70、2.42、3.63、4.84 g/L的野牡丹提取液20 mL，調pH為6，以3 BV/h通過樹脂柱進行動態(tài)吸附。②樣品液pH。取野牡丹提取液（濃度為2.42 g/L）20 mL，調節(jié)pH分別為2、4、6、8、10，以3 BV/h通過樹脂柱進行動態(tài)吸附。③最佳吸附流速。取野牡丹提取液（濃度為2.42 g/L）20 mL，調節(jié)pH 為6后通過樹脂柱進行動態(tài)吸附，流速分別控制為1、2、3、4、5 BV/h進行吸附。④最大上樣量。按已初步確定的吸附條件，將野牡丹提取液通過大孔樹脂柱進行動態(tài)吸附，按體積分步收集洗脫液。每10 mL洗脫液為1流份，共收集25流份，測定各流份的總黃酮含量，計算未吸附率，繪制泄漏曲線，確定最大上樣量。

1.2.4 單因素考察大孔樹脂的洗脫條件 設置單因素試驗考察洗脫水用量、乙醇體積分數(shù)、洗脫流速和最佳洗脫醇用量。①洗脫水用量。按上述確定的吸附條件完成動態(tài)吸附后，采用去離子水進行洗脫[12]，分步收集8 BV的水洗脫液。水洗脫液中每份取0.5 mL洗脫液采用苯酚-硫酸法反應后在490 nm處測定吸光度[13]，繪制水洗脫曲線，確定洗脫水用量。②乙醇體積分數(shù)。完成動態(tài)吸附后的大孔樹脂，先用足量的水洗去未吸附雜質，再分別用10%、30%、50%、70%和90%的乙醇溶液以3 BV/h進行洗脫，收集洗脫液至100 mL，測吸光度，計算總黃酮回收率，初步確定洗脫劑的濃度。③洗脫流速。完成動態(tài)吸附后的大孔樹脂，先用足量的水洗去未吸附雜質，以70%乙醇為洗脫溶劑，分別以1、2、3、4、5、6 BV/h的流速進行洗脫，收集洗脫液至100 mL，測吸光度，計算總黃酮回收率，確定最佳洗脫流速。④洗脫醇用量。按上述確定的吸附條件進行動態(tài)吸附后，先用足量的水洗去未吸附成分，再采用70%的乙醇對吸附后的大孔吸附樹脂柱進行洗脫，控制流速為3 BV/h，收集10 BV的洗脫液。測定吸光度，繪制醇的洗脫曲線，確定洗脫醇用量。

1.2.5 星點設計試驗 在單因素考察的基礎上，根據(jù)星點設計原理，進一步對野牡丹提取液中總黃酮吸附影響較大的3個因素樣品液pH、樣品上柱量（mL）和洗脫液乙醇體積分數(shù)（%）進行考察。每個因素取5個水平，各因素與極大極小值根據(jù)單因素考察的結果設定，各因素和水平見表1。取野牡丹提取液，調pH，上柱，經完全吸附后，乙醇洗脫，洗脫液均勻分作2份，一份依標準曲線測定總黃酮的含量，計算總黃酮的回收率；另一份經減壓干燥，精密稱定干膏質量，換算總黃酮的純度。以總黃酮的純度（Y1）和總黃酮的回收率（Y2）作為考察指標，分別對各因素各水平進行二項式擬合，繪制效應面曲線，優(yōu)化工藝參數(shù)。

2 結果與分析

2.1 野牡丹提取液總黃酮測定

在510 nm處測定蘆丁標準品系列溶液的吸光度，得回歸方程為A=13.04C+0.012 2，R2= 0.999 2。根據(jù)標準曲線及稀釋倍數(shù)測得野牡丹初提液中總黃酮的濃度為2.42 g/L。

2.2 大孔樹脂的動態(tài)吸附試驗

樹脂用95%乙醇浸泡24 h充分溶脹后，用95%乙醇淋洗至流出液與水混合（1∶5）不呈白色渾濁為止。然后以大量去離子水洗盡乙醇，備用。分別取已處理好的6種樹脂濕法裝柱，加等量的野牡丹初提液于柱頂，按柱體積以2 BV/h進行動態(tài)吸附，收集流出液，測定流出液濃度，然后再用100 mL去離子水清洗殘余成分，收集水洗液，按公式A=（M0-M流-M水）/w計算樹脂的比吸附量（mg/g）。

其中，A為比吸附量（mg/g），M0為上樣液中總黃酮質量（mg），M流為過柱流出液中總黃酮質量（mg），M水為去離子水洗脫下來的總黃酮質量（mg），w為干樹脂質量（g）。

在單因素考察吸附條件時，解吸液應對總黃酮有較大的溶解度才能保證洗脫完全。大孔樹脂動態(tài)吸附試驗結果見表2。SP-70在動態(tài)吸附試驗中具有較大的比吸附量和解吸率；NKA-9雖有較大的比吸附量，但其解吸率低。綜合動態(tài)篩選試驗比吸附量和解吸率兩個指標，試驗選擇采用SP-70樹脂分離純化野牡丹初提液中的總黃酮。由于不同植物中黃酮的種類及結構不同，適宜分離黃酮的樹脂不同，SP-70樹脂在黃酮組分純化中的應用不多，但文獻報道該樹脂也能成功分離純化黃酮組分[14，15]。

2.3 吸附條件單因素試驗結果

2.3.1 樣品液濃度的影響 不同濃度的野牡丹提取液經上樣后測得的回收率見圖1。由圖1可知，上樣液總黃酮濃度低時，大孔樹脂對野牡丹提取液總黃酮的回收率隨上樣濃度的增加而增加，上樣液濃度繼續(xù)增加，回收率降低。試驗宜采用低濃度提取液上樣，因為當樣品液中總黃酮濃度提高時，與總黃酮競爭樹脂吸附位點的雜質量也隨之增加，在流速恒定的情況下，隨上樣濃度的增加，可使野牡丹提取液總黃酮在樹脂內部擴散能力降低，樹脂提前泄漏[9]，造成回收率降低。因此，上樣液中總黃酮的濃度以2～3 g/L為宜。

2.3.2 樣品液pH的影響 樣品液pH對于總黃酮回收率的影響見圖2。由圖2可知，pH對總黃酮的回收率影響較大，當樣品液的pH為6時，可以獲得較高的總黃酮回收率。

2.3.3 吸附流速的影響 從圖3可以看出，總黃酮的回收率隨著吸附流速的增加而降低。其原因可能是當流速較快時，溶質分子尚不能完全擴散到樹脂的內表面，從而使溶質提早泄漏，但流速過慢會延長純化的時間，提高生產成本。吸附流速設定為3 BV/h為佳。

2.3.4 最大上樣量的確定 從圖4的泄漏曲線可以看出，從第7流份以后，未吸附率開始明顯增大，說明樹脂柱從第7流份時已不能完全吸附野牡丹提取液中的總黃酮。設定未吸附率10%為泄漏點以保證總黃酮保留完全，確定最大上樣量為60 mL。

2.4 洗脫條件單因素試驗結果分析

2.4.1 洗脫水用量的確定 水洗脫液吸光度與洗脫體積的變化曲線見圖5。由圖5可知，采用1 BV去離子水洗脫時有最大的吸光度，而連續(xù)洗脫3～4 BV時洗脫液中吸光度已經很小并趨于平穩(wěn)，說明此時糖類雜質等基本洗盡。試驗最終選擇采用3 BV的水洗脫去除雜質。

2.4.2 乙醇洗脫體積分數(shù) 由圖6可知，乙醇對于總黃酮的回收率影響較大，總體趨勢是隨著乙醇體積分數(shù)的增加，總黃酮回收率提高。但由于高體積分數(shù)的乙醇易揮發(fā)，會使生產成本增加，本試驗采用70%的乙醇進行下步試驗。

2.4.3 乙醇洗脫速率的確定 由圖7可知，隨著乙醇洗脫流速增加，洗脫液中總黃酮含量降低，總黃酮回收率也降低。一般流速越慢，解吸率越高，總黃酮回收率越好。但是解吸速率的選擇，還應考慮生產效率和生產成本等。本試驗最終選擇洗脫劑的流速為3 BV/h。

2.4.4 洗脫乙醇用量的確定 由圖8所示醇洗脫曲線可以看出，采用5 BV乙醇基本可以將總黃酮完全洗脫，故可確定用5 BV乙醇來洗脫樹脂吸附的總黃酮。

2.5 星點設計的試驗結果分析

以總黃酮的純度（Y1）和總黃酮的回收率（Y2）作為考察指標，按試驗方案得到的結果見表3。將所得試驗數(shù)據(jù)采用二項式擬合，分別得到回歸方程：Y1=34.118 5+4.000 2X1 +0.289 5 X2-0.106 0 X3-0.288 2 X12-0.002 94 X22-0.000 23×10-4 X32 -0.0062 6 X1X2-0.007 34 X1X3-0.000 34X2X3（R2=0.970 0，P<0.01）；Y2=2.109 1+8.048 3X1+0.759 6 X2+1.384 0 X3 -0.516 1X12- 0.011 4X22-9.981×10-3X32 +0.030 02X1X2-0.060 64X1X3+3.927×10-3X2X3 （R2=0.962 7，P<0.01）。在考察指標的二項式方程中，擬合相關系數(shù)（R2）均在0.9以上，方差分析顯示二項式模型具有顯著性差異（P<0.001），而兩個指標的失擬項分別為0.77、2.10，校正系數(shù)（R2adj）分別為0.943 2和0.929 0，說明模型可以解釋絕大多數(shù)的響應值變化。以各考察指標二項式擬合的數(shù)學模型為基礎，使用Design-Expert軟件描繪三維效應面（圖9）。使用Design-Expert軟件從優(yōu)化區(qū)域中選定最佳的純化工藝，即pH為5.45、藥品上柱量為42.1 mL、68%的乙醇洗脫。優(yōu)化后總上柱藥量占樹脂動態(tài)最大吸附量的70.2%，保證了大孔樹脂對野牡丹初提液中的總黃酮充分吸附；而采用68.0%的乙醇洗脫液，既能保證有較好的總黃酮純度和回收率，也降低了純化成本。根據(jù)優(yōu)化的純化工藝對三批野牡丹提取液提純驗證，實測得總黃酮回收率為85.38%，純度54.68%，與預測值（總黃酮回收率85.96%，純度55.36%）接近，偏差小。

3 結論

影響樹脂吸附分離總黃酮的因素很多，在實際應用中，只有綜合考慮各種因素，才能最終確定最佳吸附分離條件[16]。本研究采用星點設計法優(yōu)化野牡丹提取液的總黃酮制備工藝，單因素試驗考察了吸附樹脂的選用、樹脂吸附和洗脫的條件，并在此基礎上，考察了樣品液pH、上柱樣品液體積和乙醇洗脫體積分數(shù)對純化工藝的影響。結果表明，采用SP-70樹脂吸附分離野牡丹提取液總黃酮的優(yōu)化工藝條件為：樣品液濃度2～3 g/L，pH為5.45，上樣量為42.1 mL，吸附速率為2 BV/h，吸附完全后先以3 BV水洗去雜質，再用5 BV 68%的乙醇以3 BV/h的速率進行洗脫。星點設計法彌補了其他設計方法由于各考察因素交互影響產生的缺陷，繪制的效應面圖可方便地表達考察指標和因素的關系。SP-70樹脂在所確定的工藝條件下，能較好地純化野牡丹提取液中總黃酮，按上述條件測得總黃酮回收率為85.38%，純度為54.68%，純化工藝穩(wěn)定。

參考文獻：

[1] 代色平，劉連海，劉 慧，等.廣東省野牡丹科植物資源調查與評價[J].福建林業(yè)科技，2012，39（4）：121-126.

[2] JOFFRY S M，YOB N，ROFIEE M S，et al.Melastoma malabathricum（L.） smith ethnomedicinal uses， chemical constituents， and pharmacological properties： A review[J].Evidence-based Complementary and Alternative Medicine，2012， 2012（1）：258434-258481.

[3] 趙 鑫，張冬青，黃榮林，等.野牡丹提取液的抗氧化活性研究[J].藥物評價研究，2014，37（4）：317-321.

[4] LEE M H，LIN R D，SHEN L Y， et al.Monoamine oxidase B and free radical scavenging activities of natural flavonoids in Melastoma Candidum D. Don[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49（11）：5551-5555.

[5] 于智峰，王 敏.大孔吸附樹脂在黃酮類化合物分離中的應用[J].中藥材，2006，29（12）：1380-1384.

[6] 張 旭，王錦玉，仝 燕，等.大孔樹脂技術在中藥提取純化中的應用及展望[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（6）：286-290.

[7] 柯仲成，程小玲.枇杷葉總黃酮提取工藝的優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（7）：173-175.

[8] 肜 霖，朱 巍，程志昆，等.刺梨總黃酮的提取、純化及其在卷煙中的應用[J].湖北農業(yè)科學，2011，50（6）：1261-1265.

[9] 吳 偉，崔光華.星點設計-效應面優(yōu)化法及其在藥學中的應用[J].國外醫(yī)學藥學分冊，2000，27（5）：292-298.

[10] 馬 麗，陳家儀，陳 稚，等.星點設計-響應面法優(yōu)選枳實總黃酮的大孔吸附樹脂純化工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2014， 20（8）：33-36.

[11] 元曉梅，蔣明蔚，胡正芝.聚酰胺吸附-硝酸鋁顯色法測定山楂及山楂制品中的總黃酮含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1996，22（4）：27-32.

[12] 劉 燕，唐鐵鑫，吳美珠，等.應用大孔樹脂分離純化野牡丹總黃酮的研究[J].中國藥師，2011，14（10）：1460-1462.

[13] 陳 偉，陳 俊，林新華，等.庫拉索蘆薈多糖的分離純化和含量測定[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2005，22（2）：131-133.

[14] 劉火安，王伯初，戴傳云，等.利用大孔樹脂從葛根中分離純化總黃酮[J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2006， 15（2）：121-126.

[15] 楊榮平，王賓豪，方艾權，等.大孔樹脂分離葛根總黃酮工藝優(yōu)化[J].中成藥，2004，26（10）：12-16.

[16] 葛淑蘭，陳龍華，李中文.大孔吸附樹脂及其在黃酮類成分分離純化中的應用進展[J].中國藥師，2008，11（6）：702-705.