摘要：采用纖維素酶解法提取爬山虎（Parthenocissus tricuspidata）根皮中白藜蘆醇，考察酶解溫度、酶解時間、酶添加量、乙醇體積分數(shù)以及浸提時間對白藜蘆醇含量的影響。結(jié)果表明，爬山虎根皮中白藜蘆醇含量最高，通過單因素試驗確定了纖維素酶法提取爬山虎根皮中白藜蘆醇的最佳工藝為10 g爬山虎根皮中酶添加量40 mg、酶解時間120 min、40 ℃條件下60%體積分數(shù)的乙醇浸提24 h，測得白藜蘆醇含量為59.87 mg/kg。

關(guān)鍵詞：爬山虎（Parthenocissus tricuspidata）；酶解法；白藜蘆醇

中圖分類號：S687.3；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0449-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.047

爬山虎（Parthenocissus tricuspidata）又稱捆石龍、小蟲兒臥草、紅絲草，屬葡萄科落葉木質(zhì)藤本植株；多用于園林綠化和中醫(yī)配藥，其根莖入藥，有破血、活筋止血、消腫毒的功效[1]。爬山虎中含有蒽醌類和芪類化合物[2]，其中非黃酮芪類多酚化合物白藜蘆醇又稱芪三酚，是一種極具開發(fā)價值的天然物質(zhì)[3]。白藜蘆醇以其抗氧化、清除自由基、防止老化、抗腫瘤、保護心血管和植物雌激素的作用及保護肝的功效被人們所關(guān)注，被譽為繼紫杉醇之后的又一新綠色抗癌藥物[1-9]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇的提取方法主要有有機溶劑浸提法[4]、超聲波法[5]、酶解法[6，7]等，酶解法浸提主要用纖維素酶。纖維素是構(gòu)成植物細胞壁的主要成分之一，而細胞質(zhì)中含有植物大部分的有效成分。利用纖維素酶水解細胞壁進而獲得細胞質(zhì)中有效成分，可大大提高提取率[8]。目前，有關(guān)從虎杖[9]、葡萄[10]以及花生[11，12]中提取白藜蘆醇已有研究，而葡萄科植物爬山虎廣泛存在于生活之中，被人們視為灌木雜草，取材經(jīng)濟便捷，卻很少有研究報道。本試驗利用纖維素酶并用有機溶劑從爬山虎根皮中提取白藜蘆醇，奠定了從爬山虎中提取白藜蘆醇的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和藥品

儀器：DF-101S型恒溫水浴鍋，鞏義市英峪予華儀器制造廠制造；FA21014W型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；CS501型超級水浴鍋，上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司；SHB-Ш型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州世紀雙科實驗儀器有限公司；1500型高效液相色譜，美國Waters公司。

試劑：無水乙醇、無水甲醇（均為分析純）。

藥品：纖維素酶，江蘇銳陽生物科技有限公司（活力單位約50 000 U/g，實驗級）。

爬山虎采自遼寧科技大學(xué)生物示范園（本試驗所用均為三葉爬山虎）。

白藜蘆醇標準品：純度>98%，購自美國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 取適量爬山虎根，洗凈晾干、剝皮，剪碎（約0.25 cm2左右小塊兒），烘干。酶解浸提：稱量10 g預(yù)處理爬山虎根皮置于150 mL磨口試劑瓶中，加入一定量纖維素酶和40 ℃（纖維素酶活性為20～60 ℃）水?dāng)嚢枋估w維素酶充分溶解；在一定溫度下酶解一段時間后，加入一定量乙醇，靜置浸提；離心去沉淀，用布氏漏斗減壓抽濾得濾液，蒸除溶劑即得白藜蘆醇提取物。

1.2.2 HPLC檢測

1）色譜條件。色譜柱 SunFireTM-C18（其高×內(nèi)徑為150 mm×4.6 mm，填料粒徑為 5 μm）；流動相為甲醇-水溶液（體積比40∶60）；流速為1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測器為Waters 2414示差折光檢測器。

2）白藜蘆醇標準溶液的配制。精確稱取白藜蘆醇標準品1.500 g于50 mL容量瓶中，用甲醇超聲波溶解定容，得30.000 g/L標準品備用液。

3）標準曲線的繪制。精密吸取標準品備用液7.5、5、4、3和2 mL分別置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，配制不同濃度的白藜蘆醇標準溶液。HPLC進樣，樣品運行20 min。得HPLC流出曲線，積分得到白藜蘆醇峰面積，繪制白藜蘆醇峰面積與含量標準曲線，給出線性回歸方程：Y=6 782+1 405 916.7X，R=0.999 7，式中，Y為峰面積積分值；X為白藜蘆醇含量（mg）。

4）爬山虎根皮中白藜蘆醇含量測定。吸取約1.5 mL白藜蘆醇提取物，微孔膜過濾制成樣品溶液，HPLC測其含量。每次進樣20 μL，運行20 min，根據(jù)標準溶液保留時間確定樣品中白藜蘆醇峰位置（圖1），利用峰面積與提取物體積量乘積計算爬山虎根皮中白藜蘆醇含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 爬山虎不同部位白藜蘆醇測定

考察爬山虎不同部位白藜蘆醇含量，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，爬山虎根、莖、葉經(jīng)過浸提后均可得到白藜蘆醇，不同部位中白藜蘆醇含量為根>莖>葉。原因是由于白藜蘆醇對光不穩(wěn)定，見光易分解的性質(zhì)所致。故本試驗選取含量最多的根為試驗原材料。

2.2 爬山虎根皮中白藜蘆醇的提取工藝

2.2.1 有機溶劑浸提時間的影響 將100 mg纖維素酶溶解到40 mL的水中，在40 ℃下攪拌使纖維素酶充分溶解。取爬山虎根皮10 g放入到上述酶溶液中進行酶解90 min[1]，酶促反應(yīng)結(jié)束后加入40 mL無水乙醇使其體積分數(shù)達到50%，考察浸提時間分別為5、10、24、48和72 h對白藜蘆醇含量的影響（圖3）。由圖3可以看出，白藜蘆醇的含量隨著有機溶劑浸提時間增加而增大。當(dāng)達到24 h后，浸提已基本完全，白藜蘆醇含量不再上升；達到48 h后，反而有降低的趨勢，這是因為長時間反應(yīng)下，白藜蘆醇部分轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇苷以及高溫導(dǎo)致白藜蘆醇向逆反應(yīng)方向進行所致[12]。因此，有機溶劑的最佳浸提時間為24 h。

2.2.2 酶解時間的影響 將100 mg纖維素酶溶解到40 mL的水中，在40 ℃下攪拌使纖維素酶充分溶解。取爬山虎根皮10 g放入到上述酶溶液中進行酶解，考察酶解時間分別為30、60、90、120、和150 min對白藜蘆醇含量的影響（圖4）。由圖4可以看出，隨著酶解時間增加，白藜蘆醇含量逐漸增加，在120 min時效果最好，隨后又開始減少。原因是反應(yīng)時間的加長使酶促反應(yīng)進行得更徹底，白藜蘆醇含量也隨著增加；繼續(xù)酶解后，由于底物濃度不斷增加，可明顯看到試驗浸提液黏度增大，過濾困難，損失增加，使得可檢測出的提取物減小。本試驗選擇120 min為最佳酶解時間。

2.2.3 酶添加量的影響 分別將20、40、50、60、80 mg纖維素酶溶解到40 mL的水中，在40 ℃下攪拌使其充分溶解，考察酶添加量對白藜蘆醇含量的影響（圖5）。由圖5可以看出，酶添加量為20～40 mg時，隨著酶量的增加，根皮中白藜蘆醇含量也逐漸增大，最后達到平衡狀態(tài)。這是因為纖維素酶作為反應(yīng)的催化劑有一定的飽和性，當(dāng)達到反應(yīng)最佳劑量后，增加纖維素酶，反應(yīng)進度不再增加，甚至由于底物濃度的增加導(dǎo)致含量有降低的趨勢。故本試驗選擇酶添加量為40 mg。

2.2.4 有機溶劑體積分數(shù)的影響 將40 mg纖維素酶溶解到40 mL的水中，在40 ℃下攪拌使纖維素酶充分溶解。取10 g剪碎后的爬山虎根皮放入到上述酶溶液中進行酶解，酶解120 min，待酶促反應(yīng)結(jié)束后，加入一定量乙醇使其分別達到20%、40%、50%、60%和80%的體積分數(shù)，考察有機溶劑體積分數(shù)對白藜蘆醇含量的影響（圖6）。由圖6可以看出，爬山虎根皮中白藜蘆醇含量隨著乙醇體積分數(shù)的增大而增加，當(dāng)乙醇體積分數(shù)達到60%后，白藜蘆醇含量達到最大值，再增加乙醇體積分數(shù)，白藜蘆醇含量增加不明顯?？紤]到經(jīng)濟成本因素，應(yīng)選60%乙醇為最佳提取劑。

2.2.5 酶解溫度的影響 將40 mg纖維素酶溶解到40 mL的水中，在40 ℃下攪拌使纖維素酶充分溶解。取10 g剪碎后的爬山虎根皮，在10、30、40、50和60 ℃條件下考察酶解溫度對白藜蘆醇含量的影響（圖7）。由圖7可以看出，隨著溫度升高，酶促反應(yīng)加快，白藜蘆醇含量逐漸增大，當(dāng)溫度達到40 ℃時，提取量達到最大。溫度繼續(xù)升高，白藜蘆醇含量開始下降，這是由于溫度過高，使纖維素酶蛋白質(zhì)變性，進而致使其活性降低。因此，酶解的最適溫度為40 ℃。

3 結(jié)論

通過對爬山虎根、莖、葉中白藜蘆醇含量的比較，發(fā)現(xiàn)爬山虎根皮中含量最高，通過單因素試驗確定了纖維素酶法提取爬山虎根皮中白藜蘆醇的最佳工藝為10 g爬山虎根皮中酶添加量40 mg、酶解時間120 min、40 ℃條件下60%體積分數(shù)的乙醇浸提24 h，測得白藜蘆醇含量為59.87 mg/kg

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