摘要：利用響應(yīng)面分析法對丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）中丹酚酸B的超聲波協(xié)同酶法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取酶解時間、酶解溫度、纖維素酶用量和酶解pH進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken中心組合研究。通過響應(yīng)面分析法對提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定超聲波協(xié)同酶法提取丹參中丹酚酸B的最佳工藝為酶解時間54 min，酶解溫度49 ℃，纖維素酶用量2.70 mg/g、酶解pH 4.4。在該條件下，丹參中丹酚酸B的提取量為4.83 mg/g。

關(guān)鍵詞：丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）；丹酚酸B；纖維素酶；超聲法

中圖分類號：S567.5；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0444-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.046

丹參藥材為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根和根莖。臨床上用于通經(jīng)止痛、活血化瘀等[1]。丹參含有萜類[2]、酚酸類[3]、多糖類[4]等多種化學(xué)成分，其中丹酚酸B是丹參藥材的質(zhì)控成分之一[1]。體內(nèi)藥理試驗研究表明，丹酚酸B具有抑制口腔癌前病變[5]、保護(hù)心肌[6]、改善肺循環(huán)[7]等活性。

目前已報道的丹參中丹酚酸B的提取方法主要有煎煮法[8]、超聲波法[8]、微波法[9]、減壓提取法[10]等。其中，超聲波法是利用機(jī)械作用、空化作用、熱效應(yīng)等從而促進(jìn)有效成分從藥材中轉(zhuǎn)移至溶劑中的一個過程，具有高效、節(jié)能的特點[11]。生物酶解技術(shù)通過酶解作用可使植物細(xì)胞壁疏松、破裂，從而降低傳質(zhì)阻力，促進(jìn)有效成分的溶出，提高有效成分提取率，因而被越來越多地用于中藥有效成分的提取當(dāng)中[12]。試驗采用超聲波協(xié)同酶法提取丹參中丹酚酸B，通過響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件，為丹參中丹酚酸B的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丹參購買于重慶市中藥材市場，經(jīng)過銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院梁玉勇教授鑒定為唇形科植物丹參的干燥根莖；丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品購于中國食品藥品檢定研究院；纖維素酶（天津利華酶制劑技術(shù)有限公司，酶活力：10 000 U/g）；水為重蒸水；甲醇為色譜純；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

LC-2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-300VDB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AB-135S型十萬分之一電子天平（德國梅特勒公司）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；PHS-25型酸度計（杭州亞美電子儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永鑫實驗儀器設(shè)備廠）；FZ102微型植物粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 丹酚酸B的含量測定

1）色譜條件[1]。Diamonsil C18柱（5 μm，4.6 mm×150.0 mm）；流動相：甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59，V/V/V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：286 nm；進(jìn)樣量：10 μL。該色譜條件下理論塔板數(shù)以丹酚酸B峰計算不低于2 000。該色譜條件下測定丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品及丹參藥材得到的色譜見圖1。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱定丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品12 mg置于25 mL容量瓶中，并用75%甲醇定容至刻度，搖勻，得0.48 mg/mL丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確移取丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.15、0.30、0.60、1.20、2.40 mL至10 mL容量瓶中，用75%甲醇定容至刻度。精密吸取所配制的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測定峰面積，并以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得Y=1 329.8X-9.107，R2=0.999 9，線性范圍：0.072～1.152 μg。

3）丹參中丹酚酸B的含量測定。取濃縮至100 mL的丹酚酸B提取液，精密移取0.5 mL至25 mL容量瓶中，用75%甲醇定容至刻度，搖勻，所得溶液用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10 μL按照上述色譜條件進(jìn)行測定，并根據(jù)峰面積計算丹酚酸B的提取量。丹酚酸B提取量按照如下公式進(jìn)行計算：

丹酚酸B提取量=提取得到的丹酚酸B的質(zhì)量/丹參藥材的質(zhì)量。

1.2.2 丹參中丹酚酸B的提取工藝流程 丹參中丹酚酸B的提取工藝流程如下：丹參→干燥、粉碎（過40目篩）→酶解→微波提取→合并提取液→減壓濃縮至100 mL→測定丹酚酸B含量，并計算丹酚酸B提取量。其中，超聲波提取條件的工藝參數(shù)為：以水為提取溶劑、固液比1∶10（g∶mL）、超聲功率為300 W，超聲時間15 min提取2次。

1.2.3 單因素試驗

1）酶解時間。準(zhǔn)確稱取10 g丹參粉末置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在酶解溫度為45 ℃、纖維素酶用量為2.5 mg/g、酶解pH為4.0的條件下，考察不同酶解時間（30、40、50、60、70 min）對丹酚酸B提取量的影響。

2）酶解溫度。準(zhǔn)確稱取10 g丹參粉末置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在酶解時間為50 min、纖維素酶用量為2.5 mg/g、酶解pH為4.0的條件下，考察不同酶解溫度（35、40、45、50、55 ℃）對丹酚酸B提取量的影響。

3）纖維素酶用量。準(zhǔn)確稱取10 g丹參粉末置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在酶解時間為50 min、酶解溫度為45 ℃、酶解pH為4.0的條件下，考察不同纖維素酶用量（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/g）對丹酚酸B提取量的影響。

4）酶解pH。準(zhǔn)確稱取10 g丹參粉末置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在酶解時間為50 min、酶解溫度為45 ℃、纖維素酶用量為2.5 mg/g的條件下，考察不同酶解pH（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）對丹酚酸B提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進(jìn)一步考查酶解時間、酶解溫度、纖維素酶用量以及酶解pH對丹酚酸B提取量（Y）的影響。采用Design-Expert 8.0.6 軟件的Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理對所選變量進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計，其因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶解時間對丹參中丹酚酸B提取量的影響

由圖2可知，酶解時間在30～50 min時，丹酚酸B隨著酶解時間的延長提取量顯著升高。當(dāng)酶解時間達(dá)到50 min，丹酚酸B的提取量達(dá)到最大，隨著酶解時間的繼續(xù)延長丹酚酸B提取量增加緩慢。因此酶解時間宜選在50 min左右。

2.1.2 酶解溫度對丹參中丹酚酸B提取量的影響 由圖3可知，丹酚酸B提取量隨著酶解溫度的升高而升高。當(dāng)酶解溫度超過50 ℃后，丹酚酸B提取量有所下降。這是由于隨著溫度升高，纖維素酶活性不斷增大，但當(dāng)溫度超過纖維素酶的最適溫度時可引起纖維素酶的失活。此外，丹酚酸B的穩(wěn)定性容易受到溫度影響，溫度過高可引起丹酚酸B的降解[13，14]。因此酶解溫度宜選擇在50 ℃左右。

2.1.3 纖維素酶用量對丹參中丹酚酸B提取量的影響 由圖4可知，丹酚酸B提取量隨著纖維素酶用量的增加而升高。當(dāng)纖維素酶用量為2.5 mg/g時丹酚酸B的提取量達(dá)到最大，隨著纖維素酶用量的進(jìn)一步增加，丹酚酸B提取量增加緩慢。因此最佳纖維素酶用量應(yīng)選在2.5 mg/g左右。

2.1.4 酶解pH對丹參中丹酚酸B提取量的影響 由圖5可知，當(dāng)酶解pH為4.5時，丹酚酸B的提取量達(dá)到最大。這是由于過低或過高的pH均不利于纖維素酶酶活性的發(fā)揮，從而影響纖維素酶降解植物細(xì)胞壁的效果，最終影響植物中有效成分的提取。此外，丹酚酸B的穩(wěn)定性容易受到溶液pH影響，研究表明酸性體系有利于丹酚酸B的穩(wěn)定，但是如果酸性過強(qiáng)則會引起丹酚酸B的降解[13，14]。因此酶解pH宜選擇在4.5左右。

2.2 響應(yīng)面的試驗結(jié)果

響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。由Design-Expert 8.0.6軟件對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合得到的二元多項回歸方程為：Y=4.790+0.150X1-0.070X2+0.055X3-0.120X4+0.058X1X2+0.040X1X3+0.015X1X4-0.030X2X3-0.012X2X4+0.010X3X4-0.180X12-0.220X22-0.084X32-0.270X42。

該模型回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。由表3中數(shù)據(jù)可知，模型極顯著（P<0.000 1），失擬項（P=0.361 1）不顯著，表明回歸方程擬合度和可信度較高，試驗誤差較小，可用于指導(dǎo)丹酚酸B提取試驗。模型中決定系數(shù)為0.959 8，調(diào)整決定系數(shù)為0.919 5，表明響應(yīng)值91.95%的變化來源于所選變量；模型的變異系數(shù)為1.39%（<10%），表明試驗有良好的穩(wěn)定性。由表3可知，一次項X1、X2、X3、X4及二次項X12、X22、X32和X42均對丹酚酸B提取量的影響極顯著，而交互項對丹酚酸B提取量的影響較小。根據(jù)F值可判斷，各個因素對丹酚酸B提取量的影響順序為：酶解時間>酶解pH >酶解溫度>纖維素酶用量。

圖6是Design-Expert 8.0.6軟件根據(jù)表2數(shù)據(jù)繪制的響應(yīng)面圖，直觀描述所考察的4個因素（酶解時間、酶解溫度、纖維素酶用量、酶解pH）兩兩交互作用對丹參中丹酚酸B提取量的影響。經(jīng)過Design Expert 8.0.6軟件的分析，得到丹參中丹酚酸B酶解的最佳工藝條件為：酶解時間54.25 min，酶解溫度49.36 ℃，纖維素酶用量2.72 mg/g、酶解pH 4.40。在此條件下，丹酚酸B理論提取量為4.85 mg/g。為驗證方法的可行性，采用上述酶解條件對丹參進(jìn)行超聲-酶法提取丹酚酸B的試驗，為方便操作，將上述優(yōu)化的條件調(diào)整為酶解時間54 min，酶解溫度49 ℃，纖維素酶用量2.70 mg/g、酶解pH 4.4。在此優(yōu)化條件下做3組平行試驗，測定丹酚酸B平均提取量為4.83 mg/g，試驗結(jié)果與模型預(yù)測相對誤差僅為0.41%。

3 結(jié)論

本研究以丹參中丹酚酸B提取量為指標(biāo)，通過單因素試驗對纖維素酶用量、酶解時間、酶解pH以及酶解溫度進(jìn)行了考察。在此基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計響應(yīng)面試驗進(jìn)而建立了數(shù)學(xué)模型，得到優(yōu)化的酶解處理丹參藥材的工藝條件為酶解時間54 min，酶解溫度49 ℃，纖維素酶用量2.70 mg/g、酶解pH 4.4。在該條件下丹參中丹酚酸B的提取量達(dá)到4.83 mg/g。

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