摘要：從山東聊城地區(qū)活禽市場(chǎng)雞糞便中通過(guò)無(wú)菌操作分離、純化得到純種菌種34株，并進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢、生化鑒定試驗(yàn)。結(jié)果表明，34株菌均符合大腸桿菌（Escherichia coli）的培養(yǎng)特性。

關(guān)鍵詞：雞；大腸桿菌（Escherichia coli）；分離純化；生化鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.312.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）02-0428-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.041

雞大腸桿菌病是由大腸桿菌（Escherichia coli）中的某些致病性菌株引起的雞感染性疾病的總稱(chēng)，其中包括大腸桿菌性腹膜炎、輸卵管炎、臍炎、滑膜炎、氣囊炎、肉芽腫、眼炎等多種疾病，也有可能在心臟、胰臟、腸道出現(xiàn)黃白色肉芽腫，主要表現(xiàn)為敗血型、氣囊炎、心包炎、肝周炎和腸類(lèi)型[1]，是養(yǎng)雞生產(chǎn)中常見(jiàn)的一種傳染病，該病可增加其他病原體感染的機(jī)會(huì)，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)及食品安全有較大影響。為了解大腸桿菌的特性，并為防治該病提供科學(xué)依據(jù)，本試驗(yàn)從雞糞便中通過(guò)無(wú)菌操作獲取大腸桿菌，經(jīng)過(guò)菌種的分離、純化得到純種菌種，并進(jìn)行了革蘭氏染色、鏡檢、生化鑒定試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 糞便無(wú)菌采于山東省聊城地區(qū)活禽市場(chǎng)的健康雞，置于冰箱-4 ℃保存，備用。

1.1.2 菌種來(lái)源 CVCC1551、CVCC1553購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 試劑 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂、生化試驗(yàn)鑒定管、各種生物化學(xué)試劑均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與純化 無(wú)菌條件下將樣本分別接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后，挑取紫黑色帶金屬光澤的菌落，連續(xù)兩次接種于麥康凱瓊脂平板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。觀察麥康凱瓊脂平板上的菌落，選紅色菌落進(jìn)行抹片、革蘭氏染色鏡檢[2-5]。

1.2.2 生化試驗(yàn) 取細(xì)菌純培養(yǎng)物分別接種在吲哚試驗(yàn)管、M-R試驗(yàn)管、V-P試驗(yàn)管、枸櫞酸鹽試驗(yàn)管中，并做三糖鐵試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂穿刺試驗(yàn)、淀粉試驗(yàn)，其中觸酶試驗(yàn)立刻觀察，其他試驗(yàn)分別置37 ℃溫箱搖床培養(yǎng)。吲哚試驗(yàn)、M-R試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂穿刺試驗(yàn)、淀粉試驗(yàn)于24 h觀察，V-P試驗(yàn)于48 h滴加試劑觀察，枸櫞酸鹽試驗(yàn)于96 h觀察試驗(yàn)結(jié)果[6-8]。1.2.3 糖發(fā)酵試驗(yàn) 取細(xì)菌純培養(yǎng)物接種6種糖類(lèi)微量發(fā)酵管（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、木糖發(fā)酵管），置37 ℃培養(yǎng)24～48 h后進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特征

細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果可見(jiàn)，在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成紫黑色帶金屬光澤的菌落；在麥康凱瓊脂上形成圓形、大小均一、直徑約為2.5～3.0 mm、表面光滑濕潤(rùn)、中央輕微隆起、邊緣整齊的紅色菌落；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上形成中等大小、圓形微凸起、表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、半透明灰白色菌落，直徑約2～3 mm；在肉湯中培養(yǎng)18～24 h呈現(xiàn)混濁，管底有灰白色黏性沉淀，輕搖試管時(shí)沉淀物呈絮狀慢慢升起，部分菌株可在肉湯表面形成菌環(huán)；在SS瓊脂上生長(zhǎng)較差，呈紅色。

2.2 細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果

分離的菌種培養(yǎng)物經(jīng)涂片、革蘭氏染色鏡檢觀察，均可見(jiàn)兩端鈍圓、多數(shù)散在排列、不運(yùn)動(dòng)、偶爾有2～3個(gè)連在一起的革蘭氏陰性短桿菌。

2.3 生化鑒定結(jié)果

對(duì)分離到的34株菌分別進(jìn)行了15項(xiàng)生化試驗(yàn)，結(jié)果菌株對(duì)葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、甘露醇、三糖鐵試驗(yàn)均產(chǎn)酸產(chǎn)氣，三糖鐵試驗(yàn)均未產(chǎn)生硫化氫；M-P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)呈陽(yáng)性；枸櫞酸鹽試驗(yàn)、尿酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、淀粉試驗(yàn)呈陰性；不同菌株的蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果有差異，其余14項(xiàng)生化試驗(yàn)結(jié)果與CVCC1551、CVCC1553一致。結(jié)果符合大腸桿菌的生化特征（表1）。

3 討論

從健康雞糞便中分離到34株大腸桿菌，經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)、生化鑒定結(jié)果顯示，在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成紫黑色帶金屬光澤的菌落；麥康凱瓊脂上為表面光滑濕潤(rùn)、中央輕微隆起、邊緣整齊菌落；在SS瓊脂上呈紅色，出現(xiàn)了弱利用現(xiàn)象；生化試驗(yàn)中，34株菌均對(duì)葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、甘露醇、三糖鐵試驗(yàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣，沒(méi)有硫化氫產(chǎn)生；M-P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)呈陽(yáng)性；枸櫞酸鹽試驗(yàn)、尿酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、淀粉試驗(yàn)呈陰性；只有不同菌株的蔗糖試驗(yàn)結(jié)果稍有不同，其原因主要與大腸桿菌的菌型有關(guān)，菌型不同利用蔗糖的能力也不同。周倫江等[9]對(duì)分離的52株細(xì)菌中蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性率為59.6%，即31株菌利用蔗糖。陳曉浪等[10]在雞大腸桿菌毒力因子的流行病學(xué)及藥物敏感性分析試驗(yàn)中，在硫化氫試驗(yàn)中15株菌有2株產(chǎn)生硫化氫；蔗糖試驗(yàn)中有3株產(chǎn)酸產(chǎn)氣，12株既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣。王選年等[1]的試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的10株菌在蔗糖試驗(yàn)中有7株產(chǎn)酸產(chǎn)氣，3株既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣；在甘露醇試驗(yàn)中9株產(chǎn)酸產(chǎn)氣，1株既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣。黨巖等[11]在大腸桿菌的分離鑒定試驗(yàn)中，分離的69株致病性大腸桿菌中35株在蔗糖試驗(yàn)中產(chǎn)酸。戴建君等[12]在不同來(lái)源雞大腸桿菌致病性比較研究試驗(yàn)中，分離的90株菌的蔗糖試驗(yàn)結(jié)果中陽(yáng)性率為10%。姜秀鵬等[13]在雞地方性病原大腸桿菌的分離與鑒定試驗(yàn)中，對(duì)16株大腸桿菌進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)，其中甘露醇試驗(yàn)中2株只產(chǎn)酸未產(chǎn)氣，14株產(chǎn)酸產(chǎn)氣；蔗糖試驗(yàn)中5株只產(chǎn)酸未產(chǎn)氣，2株既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，9株產(chǎn)酸產(chǎn)氣。王寶杰等[14]在濰坊地區(qū)肉雞致病性大腸桿菌的血清型鑒定試驗(yàn)中，乳糖試驗(yàn)陽(yáng)性率為92%。秦四海[15]在臨沂市雞源致病性大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型監(jiān)測(cè)及其致病性試驗(yàn)中，乳糖試驗(yàn)陽(yáng)性率為92.5%；三糖鐵試驗(yàn)陽(yáng)性率為97.2%。劉國(guó)華等[16]在雞致病性大腸桿菌的分離與血清型鑒定試驗(yàn)中，乳糖和甘露醇試驗(yàn)陽(yáng)性率均為90%。研究表明，大腸桿菌利用蔗糖、甘露醇、乳糖、三糖鐵的能力存在差異，部分大腸桿菌可利用蔗糖，有些大腸桿菌不可利用甘露醇和乳糖，三糖鐵試驗(yàn)中產(chǎn)生硫化氫，其主要與菌型有關(guān)。本試驗(yàn)中雖然有27株菌在糖發(fā)酵試驗(yàn)中不同程度地利用了蔗糖，但綜合試驗(yàn)現(xiàn)象，最終確定34株菌均符合大腸桿菌的特性。

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