摘要：分別將煙苗接種芽孢桿菌（Bacillus subtilis）1205和煙草黑脛病菌病原菌煙草疫霉（Phytophthora parasitica Gzufp-9）在接種后1、3、5、7、9、11 d測定煙苗過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）3種與植物抗病密切相關(guān)的酶活性變化。結(jié)果表明，接種芽孢桿菌1 205后，PAL、PPO活性在5 d時(shí)達(dá)到最高值，明顯高于對照和接種煙草疫霉，POD活性在接種1 d時(shí)即達(dá)到最高值。而接種煙草疫霉后PAL、PPO活性均在3 d時(shí)達(dá)到最高值，POD活性在接種1 d時(shí)達(dá)到最高值。

關(guān)鍵詞：煙草疫霉（Phytophthora parasitica Gzufp-9）； 芽孢桿菌（Bacillus subtilis）； 抗性相關(guān)酶

中圖分類號：S432.4+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0362-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.023

煙草疫霉（Phytophthora parasitica Gzufp-9）是引起煙草黑脛病的惟一病原菌，在自然條件下寄主范圍廣泛[1]，嚴(yán)重為害作物的生長。在中國云貴川三大煙區(qū)均有不同程度發(fā)生，每年經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)億元，僅次于煙草病毒病[2，3]?；瘜W(xué)農(nóng)藥防治煙草黑脛病以甲霜靈為主，連年施用甲霜靈使用藥量逐年上升，病原菌產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治效果下降[4-7]，而且化學(xué)農(nóng)藥容易殘留土壤中污染環(huán)境。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和相關(guān)研究的深入，生物防治煙草黑脛病成為研究重點(diǎn)。植物在受到各種病原生物作用后，植物為維護(hù)其正常生長發(fā)育而產(chǎn)生一定的防御機(jī)制[8]，其中植物防御酶（如過氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL）的誘導(dǎo)產(chǎn)生就是最重要的一種生理生化抗性機(jī)制。

安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室從煙草根際土壤中分離得到一株對煙草黑脛病具有良好抑制作用的芽孢桿菌（Bacillus subtilis）1205，通過測定拮抗菌處理對煙草苗體內(nèi)過氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL的變化情況，研究拮抗芽孢桿菌1205對煙草黑脛病的作用機(jī)理，為生防菌的開發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草黑脛病病原菌煙草疫霉由貴州大學(xué)生命科學(xué)院真菌資源研究所提供。拮抗細(xì)菌為芽孢桿菌1205。

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖2.5 g，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 接種前準(zhǔn)備 將分離得到的芽孢桿菌1205經(jīng)NA斜面活化后，取兩環(huán)活化的培養(yǎng)物分別接入盛有100 mL NA培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，28 ℃，160 r/min培養(yǎng)3 d，得到拮抗菌株懸浮液。利用已分離出的煙草黑脛病病原菌煙草疫霉Gzufp-9，參照煙草疫霉孢子懸浮液制備方法[9]，制備煙草疫霉懸浮液，游動孢子的濃度為104個(gè)孢子/mL。

1.2.2 接種處理 在煙苗長有4葉1心、苗高3～4 cm時(shí)剪葉，剪去超過盤孔的根系控制大苗生長，促使小苗生長。后期剪葉兩次，促進(jìn)莖部的生長，達(dá)到煉苗的目的[10]。移栽，每盆一株，10 d后進(jìn)行處理。采用王麗珍[11]的方法，將煙草疫霉孢子懸浮液灌根接種于煙株根部土壤中。芽孢桿菌1 205采用灌根接種法，將已經(jīng)制備好的濃度為1×108個(gè)孢子/mL拮抗菌發(fā)酵液灌根接種于煙株根部土壤中。

1.2.3 酶液提取 參照Moerschbacher等的方法[12]。稱取1 g樣品，放入預(yù)冷的研缽中，加入2 mL提取液（0.1 mol/L pH 8.8硼酸鈉緩沖液，內(nèi)含5 mmol/L巰基乙醇，1 mmol/L EDTANa2），0.1 g聚乙烯吡咯烷酮及少許石英砂，冰浴研成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，再用2 mL提取液沖洗研缽及研棒，然后一并轉(zhuǎn)入離心管，在4 ℃下振蕩5 min，同樣溫度12 000 r/min離心20 min。上清液即為POD、SOD、PPO和PAL酶粗提液，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 酶活性測定方法

1）過氧化物酶POD活性測定。按Cakmak的方法[12]加以改進(jìn)，取50 μL酶粗提液加入5 mL試管中，與4.8 mL含18 mmol/L愈創(chuàng)木酚的磷酸緩沖液（0.1 mol/L pH 5.8）混合。于35 ℃水浴中反應(yīng)1 min后，加入150 μL 2.5%（V/V）H2O2起始酶反應(yīng)，記錄470 nm處的光密度值，每隔1 min記錄一次，連續(xù)記錄5 min（3 min內(nèi)的吸光值變化不超過1個(gè)吸收單位時(shí)，則酶反應(yīng)初始速度與加入的酶量呈線性關(guān)系）。以不加酶液而加相同體積的磷酸緩沖液為空白對照，以每分鐘OD470變化0.01為一個(gè)酶活單位U，用U/g表示酶活性。

2）多酚氧化酶PPO活性測定。用比色法測定[12]：取100 μL酶粗提液加入比色杯中，與4.9 mL含0.02 mol/L鄰苯二酚的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）混合，于35 ℃水浴中反應(yīng)5 min后，記錄398 nm處的光密度值，以不加酶液而加相同體積磷酸緩沖液為空白對照。以每分鐘OD398值變化0.01為1個(gè)酶活性單位U，計(jì)算酶比活性U/g。

3）苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶PAL活性測定。取酶粗提液0.5 mL，去離子水4 mL，與含0.02 mol/L L-苯丙氨酸的硼酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 8.8）0.5 mL混勻，以不加酶液而加等體積的磷酸緩沖液為對照，測定起始OD290值。將測定液倒回對應(yīng)的試管，在38 ℃水浴中反應(yīng)30 min，放入冰浴中終止反應(yīng)，再次測定OD290值，計(jì)算2次OD290的差值。以每小時(shí)OD290變化0.01為一個(gè)酶活力單位U（相當(dāng)于每mL反應(yīng)混和液中形成1 μg肉桂酸），計(jì)算酶比活性U/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種菌后煙苗PPO活性的變化

由圖1可知，煙苗經(jīng)芽孢桿菌1205接種1 d后，PPO活性顯著低于接種煙草疫霉病原菌的PPO活性，2 d后迅速上升并與之相接近，而接種煙草疫霉病原菌3 d后，煙苗PPO活性達(dá)到最高峰0.389 U/g，是清水對照的近兩倍。隨時(shí)間的延長，活性逐漸降低。接種芽孢桿菌1205 5 d后，煙苗PPO活性達(dá)到0.509 U/g，高于接種煙草疫霉病原菌，是清水對照的近三倍，在5～7 d酶活性還保持在一個(gè)較高的水平。表明CK和芽孢桿菌1205在5 d時(shí)達(dá)到最高峰，且芽孢桿菌1205的峰值顯著高于煙草疫霉病原菌和CK，持續(xù)時(shí)間也高于煙草疫霉病原菌和CK。

2.2 接種菌后煙苗POD活性的變化

由圖2可知，接種煙草疫霉1 d后，煙苗POD活性即達(dá)到最高峰0.5 U/g，是清水對照的5.7倍。隨時(shí)間的延長，活性逐漸降低。在整個(gè)測定過程中芽孢桿菌1205的酶活始終高于煙草疫霉病原菌，尤其是1 d時(shí)煙苗POD活性即達(dá)到最大值0.557 U/g，遠(yuǎn)高于清水對照。酶測定結(jié)果表明，煙苗對微生物的抗性越強(qiáng)，POD活性越強(qiáng)，持續(xù)的時(shí)間也越強(qiáng)。

2.3 接種菌后煙苗PAL活性的變化

由圖3可知，煙苗接種煙草疫霉病原菌3 d后煙苗PAL活性達(dá)到最高峰0.661 U/g，是清水對照的2.5倍，隨時(shí)間的延長，活性逐漸降低，至接種后11 d時(shí)達(dá)到最低值0.087 U/g，且低于清水對照。而接種芽孢桿菌1205 5 d后，PAL活性均顯著高于煙草疫霉病原菌和CK且達(dá)到峰值0.73 U/g，是CK的1.23倍，是接種煙草疫霉病原菌的1.17倍，持續(xù)時(shí)間也遠(yuǎn)高于清水對照和接種煙草疫霉病原菌。

3 小結(jié)與討論

過氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL等植物防御酶在植物受到各種病原生物的作用時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生，這些酶通過參與植物抗病次生物質(zhì)（如木質(zhì)素、酚類化合物、植保素）的代謝[13-15]或植物體內(nèi)活性氧AOS代謝，或直接抑制及殺死病原菌等使植物對病原物具有抗性[16]。多數(shù)研究表明，POD、PPO、PAL等酶的活性與抗病指數(shù)呈正相關(guān)，是植物抵抗病原菌侵害的一種特殊保護(hù)性反應(yīng)，因?yàn)榭共≈仓昝富钚韵鄬Ω哂诟胁≈仓闧17]，與本試驗(yàn)結(jié)果類似。在本試驗(yàn)中病原菌和芽孢桿菌1 205均能引起煙苗中3種防御酶活性的升高，只是活性程度與活性峰值產(chǎn)生的時(shí)間有所差異。經(jīng)病原菌處理的煙苗PAL和 PPO酶活性最高峰出現(xiàn)在接種后3 d ，而經(jīng)芽孢桿菌1205處理后煙苗內(nèi)PAL和PPO酶活性最高峰出現(xiàn)在接種后5 d。在第1天接種芽孢桿菌和煙草疫霉后的POD活性均達(dá)到最高值。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)芽孢桿菌1205處理后的煙苗的POD、PPO、PAL活性均普遍高于煙草疫霉處理的煙苗。

參考文獻(xiàn)：

[1] WHEELER B E J. Review of applied mycology. Plant host-pathogen index to volumes 1-40（1922-1961）[J]. Transactions of the British Mycological Society1968，51（2）：348-349.

[2] 陳瑞泰，朱賢朝，王智發(fā)，等.我國16個(gè)主產(chǎn)煙?。▍^(qū)）煙草侵染性病害調(diào)研報(bào)告[J].中國煙草科學(xué)，1997（4）：1-7.

[3] 曹明慧，冉 煒，楊興明，等.煙草黑脛病拮抗菌的篩選及其生物效應(yīng)[J].土壤學(xué)報(bào)，2011，48（1）：151-159.

[4] 王 革，鄭小波，陸家云，等.云南省煙草黑脛病菌對甲霜靈抗性的檢測[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1997，20（4）：105-107.

[5] 周向平，肖啟明，羅 寬，等.煙草黑脛病菌拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選和鑒定[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，30（5）：450-452.

[6] 王萬能，肖崇剛.煙草黑脛病的綜合防治及其研究進(jìn)展[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（2）：42-44.

[7] SHEW H D. Response of Phytophthora parasitic vat. nicotianae tometalaxy exposure[J].Plant Disease，1985（69）：559-562.

[8] JOHN A L. Plant immuneisation；From myth to SAR[J].Pestic Sci，1999，55：193-196.

[9] 鄭小波.疫霉菌及其研究技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.

[10] 王 靜，孔凡玉，秦西云，等.短小芽孢桿菌AR03對煙草黑脛病菌的拮抗活性及其田間防效[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2010，16（5）：78-81.

[11] 王麗珍.煙草根圍土壤拮抗細(xì)菌的篩選及控病研究[D].重慶：西南大學(xué)，2007.

[12] 鄒芳斌，司龍亭，李 新，等.黃瓜枯萎病抗性與防御系統(tǒng)幾種酶活性關(guān)系的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（3）：181-184.

[13] 李惠霞，王 蒂.馬鈴薯晚疫病抗性反應(yīng)中木質(zhì)素及防御酶活性的變化[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，41（3）：52-56.

[14] STICHER L，MAUCH-MANI B，BETRAUX J P. Systemic acquired resistance[J].Annu Rev Phytopathol，1997，35：235-270.

[15] STROBEL N E，JI C，GOPALAN S，et al. Induction of systemicacquired resistance in cucumber by pv.syringae 61 Hrpzpss protein[J].Plant J，1996，9：432-439.

[16] WEI Z，LABY R J，ZUMOFF C H，et al. Harpin， elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora[J].Science，1992，257：85-88.

[17] 許靈超.299個(gè)水稻品種的抗瘟基因型鑒定及4個(gè)品種的防御酶測定[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.