摘要：將溶磷菌、固氮菌和解鉀菌按功能不同兩兩組合培養(yǎng)后篩選出互相不拮抗的菌株組合，進(jìn)行三菌混合培養(yǎng)，測試得到的5組混合菌株的溶磷、解鉀能力。結(jié)果表明，混合培養(yǎng)菌的溶磷、解鉀能力均比各菌單獨(dú)培養(yǎng)時要高，其中，組合1、2和5混合培養(yǎng)時具有1+1+1>3的溶磷效果，組合3和5混合培養(yǎng)時具有1+1+1>3的解鉀效果。探索組合5的最佳培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基C/N比為25，pH 9，溫度為30 ℃時菌株生長總量最好。

關(guān)鍵詞：溶磷菌；固氮菌；解鉀菌；混合培養(yǎng)；優(yōu)化

中圖分類號：Q935 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0323-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.013

微生物是土壤肥力的核心，土壤中的微生物不僅數(shù)量巨大，而且種類極多，許多微生物對土壤氮、磷和鉀等養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和供給起非常重要的作用[1]。氮、磷和鉀均是作物生長發(fā)育必須的大量元素。解磷菌能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可溶狀態(tài)，供植物吸收利用[2]；根瘤菌能夠固定空氣中的分子態(tài)氮形成氨，為植物提供氮素營養(yǎng)；硅酸鹽細(xì)菌（又名鉀細(xì)菌）能夠分解土壤中的固定態(tài)鉀轉(zhuǎn)化為作物可以直接吸收利用的有效鉀[3，4]。同時根瘤菌、溶磷菌和硅酸鹽細(xì)菌可分泌促生長活性物質(zhì)促進(jìn)植物的生長，因此是理想的生物肥料菌種。

早在20世紀(jì)就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同菌株組合混合培養(yǎng)可以形成不同的產(chǎn)物[5]。研究認(rèn)為混合培養(yǎng)能減少或避免純培養(yǎng)過程中生物活性的下降，增加培養(yǎng)菌生物量，可以獲得更多的菌株性質(zhì)[6]。陶光燦等[7]研究了細(xì)菌組合的固氮、解磷與不同培養(yǎng)條件以及混合培養(yǎng)，研究結(jié)果表明，微生物之間存在著協(xié)同作用。如柄桿菌（Caulobacter）與藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）混合培養(yǎng)時，提高了藍(lán)細(xì)菌生物量的同時，促進(jìn)其色素的合成和積累，提高乙炔還原活力[8]。說明各菌之間可能直接或間接地相互作用，互相提供所需的營養(yǎng)，轉(zhuǎn)移或消除抑制產(chǎn)物，或通過一些物理或生化機(jī)制刺激彼此間的生理活動[9]。

本研究通過對實(shí)驗(yàn)室保存的2株固氮菌、1株解鉀菌和2株溶磷菌以及本試驗(yàn)自行篩選得到的一株溶磷菌P0417進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)，研究菌株之間的互作效應(yīng)，為符合微生物肥料的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

供試菌株為桂花樹下根際黏附的土壤篩選得到的一株溶磷菌P0417，從普通微生物保藏中心購買的2株溶磷菌，2株固氮菌和1株解鉀菌（表1）。

1.2 菌株間拮抗反應(yīng)

分別將活化后的3種功能菌菌株兩兩混合接種在LB平板培養(yǎng)基上，將一株菌的菌懸液平鋪在平板培養(yǎng)基上，另一株菌直接從斜面挑出點(diǎn)在平板上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，每天觀察交叉點(diǎn)處細(xì)菌生長狀況，若交叉點(diǎn)處產(chǎn)生了透明圈，則說明兩菌株間有拮抗作用，不適合混合培養(yǎng)；若交叉點(diǎn)處未產(chǎn)生透明圈，且生長良好，則說明兩菌株不發(fā)生拮抗作用，可以混合培養(yǎng)。

1.3 菌株溶磷和解鉀作用

1.3.1 培養(yǎng)基 PKO培養(yǎng)基（解磷培養(yǎng)基）配方如下：Ca3（PO4）2 10 g[Ca3（PO4）2單獨(dú)滅菌后加入]，葡萄糖10 g，MgSO4·7H2O 0.3 g， NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g， FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4 ·4H2O 0.03 g，（NH4）2SO4 0.5 g，pH 7.0～7.2，去離子水1 000 mL。

硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基（解鉀培養(yǎng)基）配方如下：蔗糖 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eCl3 0.005 g，CaCO3 0.1 g，Na2HPO4 2 g，鉀長石粉 2 g，去離子水1 000 mL。

液體培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖（按試驗(yàn)需求比例確定用量）；NH4SO4 0.2 g；NaH2PO4 0.05 g；K2HPO4 1.31 g； MgSO4·7H2O 0.5 g； CaCl2 0.01 g；去離子水1 000 mL。

1.3.2 菌株溶磷量的測定 采用鉬藍(lán)比色法測定上清液有效磷含量，同時根據(jù)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶磷量。

1.3.3 菌株解鉀量的測定 鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取0.190 7 g氯化鉀標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)110 ℃烘干2 h，用去離子水定容至1 L，此溶液含K 0.1 mg/mL，分別吸取該溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL定容至100 mL容量瓶中，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg/mL的氯化鉀。采用原子吸收法測定鉀離子量，以鉀濃度為橫坐標(biāo)，原子吸收光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品處理：將6株菌分別接種至硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，取發(fā)酵液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾濃縮到10 mL左右，加入6% H2O2少許，繼續(xù)蒸餾，反復(fù)處理，直至硅酸鹽細(xì)菌黏液消失為止，加水過濾至100 mL容量瓶定容，采用原子吸收法測定鉀離子量[10]。

1.4 最佳菌株組合混合培養(yǎng)條件的優(yōu)化

綜合菌株混合培養(yǎng)的溶磷和解鉀效果，選出一組效果最佳的混菌組合進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得菌體生長最佳的培養(yǎng)條件，以紫外分光度計(jì)在OD660 nm下測定菌懸液濃度作為指標(biāo)。

1.4.1 單因素試驗(yàn) 對培養(yǎng)條件的3個因素C/N比、pH和溫度進(jìn)行單因素條件優(yōu)化。菌株在LB斜面活化24 h后，按1%接種量接種于各相對應(yīng)條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每組3次重復(fù)，搖床培養(yǎng)2 d后，以不接菌為空白對照組用紫外分光度計(jì)在OD660 nm下測定菌懸液濃度。

1.4.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化 單因素優(yōu)化后設(shè)計(jì)了C/N比（20、35、30），pH（7、8、9），溫度（28、30、35 ℃）的3因素3水平的正交試驗(yàn)對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。選用L9（33）正交組合進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株間拮抗反應(yīng)

3種功能菌兩兩組合培養(yǎng)（共計(jì)11個處理），結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株1.1870和菌株1.2327混合培養(yǎng)后平板中產(chǎn)生了透明圈（圖1），其中左圖為將菌株1.1870涂布于平板，菌株1.2327以圓點(diǎn)形式點(diǎn)在平板上產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，右圖反之。這說明這兩種菌株之間產(chǎn)生了拮抗反應(yīng)，不能進(jìn)行混合培養(yǎng)，而其他菌株混合培養(yǎng)后未出現(xiàn)透明圈，說明菌株之間不會產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，可以進(jìn)行混合培養(yǎng)。

2.2 菌株單獨(dú)溶磷磷解鉀作用

6株菌的溶磷、解鉀量如表2所示，由表2可見，菌株1.867溶磷量最高，為952.04 μg/mL，菌株1.2411的解鉀量最高，為2.85 μg/mL。

2.3 菌株混合培養(yǎng)溶磷解鉀作用

2.3.1 菌株組合處理 在3株溶磷菌，2株固氮菌，1株解鉀菌中，任意挑選每種功能菌各一株進(jìn)行三菌株組合培養(yǎng)，去除產(chǎn)生拮抗作用的菌株組合，得到如下5組三菌株組合菌：①P0417+1.2327+1.2411；②P0417+1.2391+1.2411；③1.867+1.2391+1.2411；④1.867+1.2327+1.2411；⑤1.1870+1.2391+1.2411。

2.3.2 組合菌的溶磷解鉀效果 將上述5組組合菌分別進(jìn)行混合培養(yǎng)后，其溶磷解鉀效果如表3和表4所示。組合1、組合2和組合5混合培養(yǎng)后其溶磷量實(shí)際值分別比理論值高117.35、592.86和851.31 μg/mL，說明這3組組合混合培養(yǎng)后的溶磷量達(dá)到1+1+1>3的效果，其中，組合2和組合5的溶磷效果更佳。而組合3和組合4的實(shí)際溶磷量小于理論值，溶磷效果不佳。解鉀效果上，5種組合的解鉀量均達(dá)到1+1+1>3，其中組合3的差值為2.11 μg/mL，組合5的差值為2.38 μg/ml，這兩組組合的解鉀效果更佳。綜合溶磷和解鉀效果，最終確定組合5即菌株1.1870、1.2391和1.2411混合培養(yǎng)時溶磷解鉀的效果最好。

2.4 最佳菌株組合混合培養(yǎng)條件的優(yōu)化

分別選用C/N比20、25、30、35和40作為組合5混菌培養(yǎng)時的培養(yǎng)基組成，培養(yǎng)2 d后發(fā)現(xiàn)C/N比為25時菌株混合生長狀況最佳（圖2）。選用pH 5、6、7、8和9的培養(yǎng)基分別進(jìn)行培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)pH 8條件下菌株生長最好（圖3）。選用溫度為25、28、30、35和37 ℃為其生長溫度進(jìn)行培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)30 ℃時菌株生長最好（圖4）。

正交試驗(yàn)優(yōu)化組合5培養(yǎng)條件分析結(jié)果如表5所示，方差分析結(jié)果如表6所示。綜合正交試驗(yàn)結(jié)果（表5）的K值和極差R大小與方差分析（表6）可知，影響3株菌株混合生長量的順序?yàn)镃>B>A，即溫度>pH>C/N比，因此溫度是影響菌株生長量的主要原因，其次是pH，最后是C/N比。菌株的理論最優(yōu)培養(yǎng)條件為A2B3C3，即C/N比為25，pH 9，溫度為30 ℃。因此，在該優(yōu)化培養(yǎng)條件下進(jìn)行了補(bǔ)充試驗(yàn)，接種活化第2代3株供試菌株，同條件下培養(yǎng)后生長量OD600 nm為1.109，比原優(yōu)化前培養(yǎng)液生長量高，因此調(diào)整后的培養(yǎng)條件更有利于3株菌株混合共同培養(yǎng)。

3 小結(jié)與討論

在自然界中微生物是以混居狀態(tài)存在的，對于它們之間相互關(guān)系的了解有助于人類有意識地充分發(fā)揮其互作效應(yīng)[11]。微生物之間存在著協(xié)同、競爭、拮抗、捕食等作用，探討其具體關(guān)系有助于進(jìn)一步開發(fā)微生物單一菌劑及復(fù)合菌劑[12]。目前中國微生物肥料發(fā)展迅速，所用的菌種主要是解磷菌、解鉀菌和固氮菌，謝應(yīng)先[13]報道這3種細(xì)菌都是土壤習(xí)居菌，相互之間沒有抑制作用或只有微弱的抑制作用，解磷菌還能促進(jìn)其他細(xì)菌生長繁殖。目前已有研究結(jié)果表明，這3種菌株間混合培養(yǎng)可以顯著提高微生物的生物量和生理代謝功能[14]。如已有報道硅酸鹽細(xì)菌具有提高土壤中速效鉀、磷含量，及作物產(chǎn)量和品質(zhì)等作用[15-17]，但目前國內(nèi)在這方面的研究較少[18]。

本試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室所保存的2株溶磷菌、2株固氮菌和1株解鉀菌以及實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的1株溶磷菌共6株細(xì)菌分別進(jìn)行單菌株培養(yǎng)和混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)每一株菌溶磷解鉀能力存在一定差異。單菌發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)圓褐固氮芽孢桿菌1.2391沒有溶磷能力，豌豆根瘤菌1.2327有少許溶磷能力，菌株P(guān)0417和熒光假單胞菌1.867的溶磷能力較強(qiáng)，環(huán)狀芽孢桿菌1.2411和巨大芽孢桿菌1.1870的解鉀效果較好。通過拮抗試驗(yàn)得出5組組合菌，將每組在同條件下培養(yǎng)發(fā)酵，結(jié)果表明，混合培養(yǎng)發(fā)酵液的溶磷、解鉀能力與單個菌株相比有大幅度提高，其中組合2和組合5中表現(xiàn)出強(qiáng)大的溶磷促進(jìn)作用，此組合體現(xiàn)出1+1+1>3的溶磷效果，而組合3和組合4則未體現(xiàn)出1+1+1>3的溶磷效果，這可能是由于營養(yǎng)及空間上的限制，導(dǎo)致互相之間產(chǎn)生一定的抑制作用。在解鉀能力上，組合3和組合5表現(xiàn)出較強(qiáng)的解鉀促進(jìn)作用，其他3組也有一定程度的促進(jìn)作用。通過溶磷和解鉀的雙重作用比較，選擇組合5為菌株最佳組合。進(jìn)一步探索組合5混合培養(yǎng)最佳發(fā)酵條件，得出當(dāng)培養(yǎng)基C/N比為25，pH 9，溫度為30 ℃時菌株生長量最好，這為新型微生物菌肥的研制和開發(fā)奠定了理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。

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