摘要：以柴油為惟一碳源，用富集、馴化培養(yǎng)基從舟山港口柴油污染海水和海泥中篩選得到4株高效柴油降解酵母菌（Yeast）C1、C2、D1、D3，其柴油降解率為（70.49±2.50）%～（78.76±1.24）%。對4株菌進行3菌和4菌的相同比例的隨機組合構(gòu)建混合菌群，從中篩選得到最佳柴油降解復(fù)合酵母菌S1-5（C2+D1+D3），降解率達到（85.30±1.29）%。再通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征分析及16S rDNA、26S rDNA測序等方法對構(gòu)成最佳降解復(fù)合菌的3株單菌進行鑒定。通過分子鑒定，得到酵母菌C2、D1、D3都是耶羅維亞酵母屬（Yarrowia），其中C2和D3是解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）。在模擬污染水域?qū)嶋H物化條件的基礎(chǔ)上優(yōu)化培養(yǎng)條件，優(yōu)化試驗獲得酵母復(fù)合菌S1-5的最佳培養(yǎng)條件為鹽度30‰，NH4NO3 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，KCl 1 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 50 mg/L，在該條件下其降解率達到（82.79±1.38）%。

關(guān)鍵詞：酵母菌（Yeast）；柴油降解；篩選；鑒定；優(yōu)化

中圖分類號：X172 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0318-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.012

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人類對能源的需求量日益增加，對油氣資源的利用開發(fā)也日益加強，柴油就是其中之一。柴油是石油提煉后的一種油質(zhì)產(chǎn)物，由不同的碳氫化合物混合組成。它主要作為汽車、飛機、鐵路車輛等運載工具或其他機械用器的燃料，也可用來發(fā)電、取暖。但柴油用處廣的背后也存在隱患，因為石油是由飽和烴、芳香烴類化合物和少量的瀝青質(zhì)、樹脂類等組成的復(fù)雜混合物，通過單一的石油降解菌難以將石油從環(huán)境中徹底去除[1-3]，而柴油身為其產(chǎn)物，亦是如此，所以就會造成難以自然去除的污染。

比如其含有較多雜質(zhì)，燃燒時容易產(chǎn)生煙塵，造成空氣污染；在冶煉、儲存、運輸?shù)冗^程中柴油產(chǎn)生的泄漏也會造成水體、土壤和大氣等環(huán)境污染[4]，并且油類污染物具有致癌、致畸、致突變等作用，容易在生物體內(nèi)富集，嚴重危害和影響生態(tài)系統(tǒng)及人體健康[5]。因此對柴油污染采取人為措施十分必要，其中微生物處理相較于物理、化學(xué)方法較為突出，因為它的安全性高，無二次污染，且操作簡單。研究表明，環(huán)境中存在許多以石油類污染物為惟一碳源的微生物[6，7]，它們能夠快速、有效的去除石油類污染物。還有研究發(fā)現(xiàn)微生物在寒冷、鹽堿、厭氧等不利環(huán)境條件下也能降解柴油[8-10]。在微生物中，酵母菌處理又具一定優(yōu)勢，因為其在處理負荷、需氧量和耐滲透壓方面具有較大優(yōu)勢[11]，且酵母菌為真菌，在分解酶方面具有特異性[12，13]。

基于以上原因，本研究從港口柴油污染海水和海泥中篩選得到能高效降解柴油的酵母菌，并對其做了形態(tài)學(xué)觀察，生理生化和分子方面的鑒定，為酵母菌降解柴油的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴油降解酵母菌的分離與純化

在可降解柴油的混合菌群中初步劃線分離篩選出15株酵母菌單菌落，純化后以液體石蠟做保護劑保種，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 柴油降解率的測定

將初篩得到的15株柴油降解菌置于含500 mg/L柴油的人工海水培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，用紫外分光光度法測定柴油降解率。在最大吸收峰225 nm的波長下測定標(biāo)準柴油濃度的吸光度，得到以柴油濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準曲線。標(biāo)準曲線的回歸方程式為：y=0.004 5x-0.009 9，R2=0.993 9。式中，y為樣品吸光值；x為所測樣品的柴油濃度。

初篩降解菌的柴油降解率見表2。由表2可見，單菌株中C1、C2、D1、D3的降解率均超過70%，以D3降解率最高，為（78.76±1.24）%。另有9株菌的柴油降解率在40%～70%之間，其中C6、C7、C9、D5、D6菌株柴油降解率差異非常小，均在66%左右。

2.3 柴油降解菌的鑒定

對分離到的高效柴油降解酵母菌C2、D1、D3進行初步的形態(tài)觀察和生理生化鑒定。由形態(tài)觀察可知，酵母菌C2菌體呈桿狀或球狀，一般呈單個或成對；酵母菌D1菌體呈桿狀或球狀，一般呈單個；酵母菌D3菌體較C2、D1小，呈桿狀或球狀，一般呈單個。分析表3可知，酵母菌C2不能利用側(cè)金盞花醇，肌醇、山梨醇、D-乳糖、D-麥芽糖、D-松叁糖、D-棉子糖；酵母菌D1不能利用側(cè)金盞花醇。

將菌株C2，D1和D3的26S rDNA在GenBank中進行序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。由圖1可見，C2、D3均與Yarrowia lipolytica MO-Y5（GU373759）處于同一分支上，序列相似性很高，親緣關(guān)系最近。因此C2、D3菌株可初步鑒定為解脂耶羅維亞酵母。D1菌株較為特殊，游離于樹外，但距離較短，結(jié)合對單菌株重建系統(tǒng)樹發(fā)現(xiàn)其同樣與解脂耶羅維亞酵母同源，另圖1也顯示3株酵母在形態(tài)特征上有一定差異，其中C2和D3相似，D1菌株相對于前兩者顯示菌體略長，故初步鑒定D1菌為耶羅維亞屬（Yarrowia sp. D1）。

2.4 復(fù)合降解菌優(yōu)化試驗

對上述篩選獲得的菌株進行簡單染色后，在光鏡下觀察其形態(tài)進行初步區(qū)分后，選取酵母菌菌株中柴油降解率較高的4株單菌作為混合菌的種子菌株。對種子菌株分別進行3菌和4菌的隨機等比例組合。酵母菌的5種復(fù)合菌組合在含500 mg/L柴油的人工海水培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，用紫外分光光度法測定柴油降解率。測定結(jié)果見表4，由表4可見，酵母菌復(fù)合菌降解率均在75%以上，其中有4個混合菌組合降解率達到80%以上，以S1-5（C2+D1+D3）的降解率最高，達（85.30±1.29）%。

選擇酵母菌混合菌S1-5及酵母菌中降解率最高的單菌（D3）在模擬污染水域?qū)嶋H物化條件的基礎(chǔ)上分析其柴油降解率。

培養(yǎng)條件的優(yōu)化。將篩選得到的最佳降解復(fù)合菌接入鹽度分別為24‰、27‰、30‰、33‰的含500 mg/L柴油的人工海水培養(yǎng)基中，pH 8.0，28 ℃，150 r/min恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)3 d后，測定柴油降解率，如圖2所示。

由圖2可見，酵母菌復(fù)合菌S1-5在鹽度24‰、27‰、30‰、33‰能正常生長，對柴油有較好的降解作用，最適鹽度為30‰，而單菌D3在鹽度為33‰時達到最佳降解效果?？梢姴煌甑淖钸m鹽度存在差別，而復(fù)合菌因為菌種之間存在相互作用，所適應(yīng)的鹽度也會與單個菌株有所區(qū)別。

對人工海水培養(yǎng)基中NH4NO3、MgSO4·7H2O、KCl、FeCl3·6H2O 4個組分作4因素3水平正交試驗，配制9種不同的人工海水培養(yǎng)基，鹽度30‰，測定柴油降解率，其結(jié)果見圖3，酵母菌復(fù)合菌的最佳降解條件為A3B1C3D2，即NH4NO3 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，KCl 1 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 50 mg/L，降解率達（82.79±1.38）%。

利用SPSS17.0軟件分析各因子對酵母復(fù)合菌S1-5降解率的影響。NH4NO3及FeCl3·6H2O對復(fù)合酵母菌對柴油的降解率都有很大的影響（P<0.01），其影響排序為NH4NO3>MgSO4·7H2O>FeCl3·6H2O>KCl。結(jié)合單因素統(tǒng)計量表中的均數(shù)估計發(fā)現(xiàn)A3、B1、C3及D2均數(shù)最大，降解率分別達到74.874 3%、73.636 3%、71.659 0%及71.733 7%。經(jīng)SPSS分析預(yù)計酵母菌復(fù)合菌S1-5的最佳培養(yǎng)條件為A3B1C3D2，與前述相同。

對石油污染海水進行處理時，石油成為石油降解菌可利用的生長元素來源，但石油主要提供的為C、H元素，其他元素（特別是N、P、金屬離子）的缺乏可能導(dǎo)致石油難以被降解。培養(yǎng)基中添加低濃度的Mg2+、K+和Fe3+都能促進細菌復(fù)合菌對石油烴的降解，這是因為微生物在生長過程中需要這些微量元素[16，17]。研究表明，不同氮磷比對菌株的生長和石油烴的降解是有一定影響的，適量的氮磷的添加可以促進微生物的生長。同時添加外源營養(yǎng)物，并非越多越好，只有在一定量的范圍內(nèi)才能具有促進作用[18]。

3 小結(jié)

從舟山某港口被柴油污染的海水和海泥中篩選得到4株高效柴油降解酵母菌C1、C2、D1、D3，通過測量，得到柴油降解率范圍為（70.49±2.50）%～（78.76±1.24）%。對這4株菌進行3菌和4菌的等比例的隨機組合，構(gòu)建混合菌群，從而篩選得到最佳柴油降解復(fù)合酵母菌S1-5（C2+D1+D3），降解率達到（85.30±1.29）%。

采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征分析及16S rDNA、26S rDNA測序等方法對C2、D1、D3進行鑒定，鑒定表明酵母菌C2、D3為解脂耶羅維亞酵母，D1在形態(tài)上與兩者略有不同，以單菌株與GenBank上的相似序列比對分析，發(fā)現(xiàn)其屬于解脂耶羅維亞酵母，但3株菌共同比對時，發(fā)現(xiàn)D1與C2及D3親緣關(guān)系上有一定距離。所以復(fù)合菌S1-5中C2和D3為同一種菌，D1為關(guān)系非常接近的菌株，3者組合在一起后，降解柴油的效率明顯提高，這就說明在選育混合菌時不僅可以構(gòu)建不同菌種的混合模式，也可以構(gòu)建同種不同菌株的混合模式。

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