劉雙鳳 王華生

（湖南省農林工業(yè)勘察設計研究總院，湖南 長沙 410007）

山核桃（Carya cathayensis Sarg.）是胡桃科山核桃屬植物，主要分布在浙、皖兩省交界的天目山一帶，是中國特產的優(yōu)良干果、油料樹種［1，2］。目前，山核桃大部分被用于油脂榨取，壓榨后的餅粕基本被直接丟棄［3］。研究［4，5］發(fā)現(xiàn)，山核桃餅粕中約含有20%的蛋白質，其蛋白的效價與動物蛋白相近，含有多種人體必需氨基酸，尤其是精氨酸、谷氨酸、組氨酸、酪氨酸的含量非常高，且必需氨基酸的含量比例合理，接近聯(lián)合國糧農組織和世界衛(wèi)生組織規(guī)定的標準氨基酸配比，具有很高的食用價值和保健功能。

目前用于蛋白提取的方法主要有十六烷基三甲基溴化銨法、尿素法、脂肪酸鹽法、堿提酸沉法等［6］，其中堿提酸沉法因為操作簡單、提取率高，被廣泛應用于實際生產中［7］，其在山核桃餅粕上的應用也倍受關注。趙見軍等［8］曾對核桃粕中蛋白的提取工藝進行優(yōu)化，但其采用的超聲波輔助浸提法，由于設備的限制離實際生產應用還有一定距離。楊瑾等［9］曾優(yōu)化了堿提酸沉法提取山核桃餅粕的工藝，但其是以冷凍干燥后的粗蛋白為評價指標，有失偏頗。

本課題汲取前人［8，9］的研究經驗并做適當調整，以山核桃為原料，借助二次正交旋轉組合試驗設計，對堿提酸沉法提取山核桃餅粕蛋白工藝進行優(yōu)化，以期為山核桃資源的充分利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷榨山核桃餅粕：河北黃金龍食用油有限公司；

牛血清白蛋白：≥98.5%，上海金穗生物科技有限公司；

石油醚（60～90℃）、氫氧化鈉、鹽酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器設備

搖擺式粉碎機：DFY－500D型，溫嶺市林大機械有限公司；

智能型蒸餾器：HR－1000型，上海華睿儀器有限公司；

數(shù)顯定時消化爐：HR－08型，上海華睿儀器有限公司；

臺式高速離心機：TG16－WS型，湖南湘儀科學設備有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－8型，江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠；

冷凍干燥機：FD－2A型，上海爭巧科學儀器有限公司；

臺式精密酸度計：TP310型，上海雷磁新涇儀器有限公司；

可見分光光度計：722N型，上海圣科儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

山核桃餅粕→粉碎（過30目篩）→干燥（50℃，24h）→脫脂（索氏抽提8h）→調至堿性（NaOH）→恒溫浸提→離心（3 000r/min，20min）→上清液→調至酸性（HCl）→離心（3 000r/min，20min）→沉淀→洗至中性（蒸餾水）→真空冷凍干燥（－10℃預凍12h，－30℃干燥24h）→山核桃蛋白

1.3.2 山核桃餅粕蛋白等電點的測定 準確稱取山核桃餅粕20.0g于燒杯中，按料液比1∶15（m∶V）加入蒸餾水，用1mol/L的NaOH溶液調節(jié)體系pH至9.0，于50℃的恒溫水浴鍋內浸提120min。浸提完成后，3 000r/min離心20min，獲取上清液。取1mL待測液（將1mL的提取上清液定容至100.0mL）用分光光度計測吸光度值（在595nm波長下），并根據(jù)標準曲線（詳見1.3.6）計算出蛋白質含量；另取7份15mL的上清液，以1mol/L的HCl溶液調節(jié)體系pH 分別為 3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，分別離心（3 000r/min，20min）并取1mL稀釋了100倍的上清液用可見分光光度計測吸光度值（在595nm波長下），根據(jù)標準曲線（詳見1.3.6）計算出蛋白質含量。以式（1）計算山核桃餅粕蛋白質的沉淀率，最大時的pH值即為其等電點。

式中：

R1——山核桃蛋白質的沉淀率，%；

m1——酸沉前的蛋白質含量，mg/mL；

m2——酸沉后的蛋白質含量，mg/mL。

1.3.3 單因素試驗設計

（1）提取時間：在提取溫度為50℃、料液比為1∶15（m∶V）、pH 為9.0的條件下，考察提取時間（30，60，90，120，150，180min）對山核桃餅粕蛋白提取率的影響。

（2）提取溫度：在提取時間為120min、料液比為1∶15（m∶V）、pH 為9.0的條件下，考察提取溫度（40，45，50，55，60，65℃）對山核桃餅粕蛋白提取率的影響。

（3）料液比：在提取時間為120min、提取溫度為55℃、pH為9.0的條件下，考察料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，m∶V）對山核桃餅粕蛋白提取率的影響。

（4）pH值：在提取時間為120min、提取溫度為55℃、料液比為1∶20（m∶V）的條件下，考察pH（8，9，10，11，12）山核桃餅粕蛋白提取率的影響。

1.3.4 二次正交旋轉組合優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗的結果，并考慮到TP310型臺式精密酸度計靈敏度的實際情況，固定浸提的pH為9.0不變，以提取時間、提取溫度、料液比為試驗因素，山核桃粕蛋白提取率為響應值，采用二次正交旋轉組合試驗設計對提取工藝進行優(yōu)化。

1.3.5 山核桃餅粕中蛋白質含量的測定 按GB 5009.5—2010執(zhí)行。

1.3.6 上清液中蛋白含量的測定 采用考馬斯亮藍法。

（1）繪制標準曲線：參照文獻［10］的方法，以蛋白質含量（X，mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線得線性回歸方程A＝4.951 4X－0.013 5（R2＝0.998）。

（2）對樣品的測定：將離心分離后的山核桃餅粕蛋白提取液定容至100mL，靜置后取出1mL稀釋100倍待測。測定時，取待測液1mL參照文獻［10］測吸光度A值，并計算蛋白含量。

1.3.7 蛋白質提取率的測定 蛋白質提取率按式（2）計算：

式中：

R2——蛋白沉淀率，%。

m3——上清液蛋白含量，mg/mL；

m4——脫脂后山核桃餅粕中的蛋白含量，mg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每次試驗重復3次，結果以珚x±s表示。運用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，顯著水平取P＜0.05（差異顯著）；借助DPS 7.05進行二次正交旋轉組合優(yōu)化試驗。

2 結果與分析

2.1 山核桃餅粕蛋白等電點分析

由圖1可知，在浸提液pH為3.0～6.0時，隨著pH的增加，蛋白的沉淀率呈先增后減的趨勢，在pH為5.0時，沉淀率最大（P＜0.05）。這與文獻［8］報道的當pH 值在5.0時蛋白質沉淀迅速，離心后上清液清亮，效果較好的情況一致，故山核桃蛋白的等電點是pI為5.0。

圖1 pH對蛋白沉淀率的影響Figure 1 Ettects of pH values on protein deposition rate

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取時間對山核桃餅粕蛋白質提取率的影響 由圖2可知，隨著提取時間的延長，山核桃餅粕蛋白的提取率逐漸增加；當提取時間為120min時，蛋白的提取率增幅趨于平緩（與150min時沒有顯著性差異，P＞0.05）。故提取時間宜控制在120min左右。

圖2 提取時間對提取率的影響Figure 2 Ettects of different extraction time on protein yield

2.2.2 提取溫度對山核桃餅粕蛋白提取率的影響 由圖3可知，隨著提取溫度的升高，蛋白質提取率呈先增后減的趨勢，當提取溫度為55℃時提取率達到最大值（P＜0.05）?？赡芘c蛋白質分子構象隨著提取溫度的升高而發(fā)生改變有關，提取溫度的升高，促進了山核桃蛋白立體結構的伸展，使其在水分子的熱運動下更易溶解［11］；當提取溫度過高時，使得維持蛋白質空間構象的次級鍵斷裂，天然構象解體，蛋白變性，提取率降低［12］。故提取溫度宜控制在55℃左右。

圖3 提取溫度對提取率的影響Figure 3 Ettects of different extraction temperature on protein yield

2.2.3 料液比對山核桃餅粕蛋白提取率的影響 由圖4可知，當料液比≤1∶20（m∶V）時，蛋白提取率隨其增大而增加（P＜0.05），之后趨于穩(wěn)定?？赡苁窃谳^低料液比時，由于溶液的黏度較大，分子擴散速率較低，體系分散不均勻，導致體系中的蛋白溶出困難；隨著液料比的增大，蛋白質更易溶出，因而提取率增加，直至其完全浸出，體系保持動態(tài)平衡，提取率不再改變［13］。故料液比宜控制在1∶20（m∶V）左右。

圖4 料液比對提取率的影響Figure 4 Ettects of different extraction solid－liquid ratio on protein yield

2.2.4 pH值對山核桃餅粕蛋白質提取率的影響 由圖5可知，當pH值為9.0時蛋白提取率最高（P＜0.05），過高或者過低的pH值都不利于蛋白的提取。可能是蛋白的基本結構中含有氨基和羧基兩種官能團，不同的pH環(huán)境會影響其存在的方式，進而改變溶出效果。并考慮到TP310型臺式精密酸度計靈敏度的實際情況，確定后續(xù)試驗提取液的pH 值為9.0。

圖5 pH值對提取率的影響Figure 5 Ettects of different extraction pH on protein yield

2.3 二次正交旋轉組合試驗結果

二次正交旋轉組合設計的因素水平安排及試驗結果分別見表1、2。

表1 二次正交旋轉組合設計因素水平表Table 1 Factors and code levels of quadratic orthogonal rotation combination design

表2 二次正交旋轉組合試驗結果Table 2 The test results of quadratic orthogonalrotation combination design

對試驗結果進行擬合得到回歸方程：

由表3可知，回歸方程的失擬性檢驗F1＝2.598 20＜F0.01（5，8）＝3.69不顯著（P＝0.076 8＞0.05），說明所選的二次回歸模型適當；回歸顯著性檢驗F2＝6.253 04＞F0.01（9，13）＝4.17極顯著（P＝0.004 7＜0.01），說明模型的預測值與實測值接近，模型成立［9］。在α＝0.10顯著水平剔除不顯著項后，得到簡化后的回歸方程：

由式（4）的各項系數(shù)可知，對山核桃餅粕蛋白提取率影響較大的因素依次為X1（提取時間）＞X3（料液比）＞X2（提取溫度），且這3因素之間不存在差異顯著性（P＜0.05）的兩兩交互作用，故未列出等高線及交互作用圖。

由表4可知，在95%的置信區(qū)間內當提取時間為124～130min，提取溫度為53～57℃，料液比為1∶22～1∶26（m∶V），pH值9.0時，山核桃蛋白的提取率較高。為節(jié)約生產成本，在實際應用中選定各因素的最低值，即提取時間124min，提取溫度53℃，料液比1∶22（m∶V），并進行5次驗證實驗，其山核桃蛋白的平均提取率為（67.94±0.05）%，與預測最高值67.98%不存在顯著性差異（P＜0.05），說明擬合所得的回歸方程能較好地指導山核桃蛋白的提取。

表3 試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of test results

表4 各因素的頻率分布Table 4 The probability distribution of values of each variable

3 結論

（1）山核桃蛋白的等點電為pI 5.0，這與文獻［6］報道的（pI 4.5～5.5）結果相近，但在該等電點下的最大沉淀率僅為89.8%，要低于文獻［6］報道的94.5%，可能是試驗原料及蛋白質檢測方法的差異造成的。由于本試驗選用的考馬斯亮藍法極易受到樣品中多糖等成分的干擾，所以其檢測線性范圍和結果的準確性均比文獻［8］所用的雙縮脲法差，下一步將針對此進行對比試驗，以明確山核桃蛋白的等電點。

（2）山核桃蛋白的最佳提取條件為：pH 9.0，提取時間124min，提取溫度53℃，料液比1∶22（m∶V），在該條件山核桃餅粕蛋白的平均提取率為（67.94±0.05）%，與預測的最高值67.98%不存在顯著性差異（P＜0.05）?？紤]到考馬斯亮藍法僅能檢測水溶性蛋白［14］，故推測山核桃中的實際蛋白含量要高于該值，未來將借助于液相色譜等技術對其進行精確測定。

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