張鳳梅，李勝水，李秀清，孫鳳莉，許 華，李雙標(biāo)

1.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科，河北 滄州061001;2.河北省滄州市人民醫(yī)院病理科;3.河北省滄州市中心醫(yī)院胸外科

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一。淋巴結(jié)及網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移是其最常見的轉(zhuǎn)移方式，與胃癌預(yù)后關(guān)系密切［1］。整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，以依賴PI-3K 方式激活，通過磷酸化蛋白激酶B(PKB)等下游底物使細胞外信號向下游傳遞，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，它能促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［2］。基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (matrix metalloproteinases-9，MMP-9 )主要降解以Ⅳ型膠原為主的基底膜屏障，對于腫瘤形成是非常重要的［3-4］。近年研究表明ILK 和MMP-9 在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用［5］。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測ILK 和MMP-9 在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達，分析二者與胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院2010 年1 月-2013 年1 月的胃癌手術(shù)石蠟標(biāo)本共80例，男55 例，女25 例，年齡36 ～86 歲。術(shù)前均未經(jīng)放化療及其他生物治療，臨床病理資料完整。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，3 μm 連續(xù)切片備用。另選取30 例經(jīng)胃鏡組織學(xué)檢查相對正常的胃黏膜標(biāo)本作為對照組。

1.2 主要試劑及方法 采用免疫組織化學(xué)SP 法進行染色。ILK(兔抗人單克隆抗體)、MMP-9(兔抗人多克隆抗體)及SP 免疫組化試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。染色過程嚴(yán)格按說明書進行，用已知陽性組織切片作陽性對照，用PBS(pH7.4)代替一抗作陰性對照，染色步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進行。

1.3 結(jié)果判定 ILK 陽性:棕色顆粒分布于胞漿或胞膜，呈均質(zhì)狀。MMP-9 陽性主要表達于腫瘤細胞胞漿和胞膜中，呈黃色細顆粒狀，散在點狀分布。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):按染色強度記分，無染色為0 分，淺黃色為1分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分;再按陽性細胞所占的百分比記分，未見染色細胞為0 分，＜25%為1 分，25% ～50%為2 分，＞50%為3 分;兩者相加，＜3 分為陰性，≥3 分為陽性。所有評判均由同一病理醫(yī)師完成。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。免疫組織化學(xué)結(jié)果與臨床病理參數(shù)間關(guān)系的統(tǒng)計采用χ2檢驗，相關(guān)性檢驗采用Spearman 等級相關(guān)檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ILK 和MMP-9 在胃癌中的表達 胃癌患者中44 例(55. 0%)ILK 蛋白陽性表達、53 例(66. 3%)MMP-9 蛋白陽性表達;對照組中ILK 和MMP-9 的陽性率分別為6. 7% (2/30)和10. 0% (3/30);ILK 和MMP-9 在胃癌組織中較正常胃黏膜組織中的表達高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見圖1 ～2、表1)。

表1 ILK 及MMP-9 在胃癌組及對照組中的表達［例數(shù)(%)］Tab 1 Expression of ILK and MMP-9 in gastric cancer group and normal control group［n(%)］

2.2 ILK 和MMP-9 的陽性表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 80 例胃癌患者中ILK 和MMP-9 陽性表達與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P ＜0.05)，而與患者的年齡、性別及腫瘤大小無相關(guān)性(P ＞0.05，見表2)。

表2 ILK 和MMP-9 的表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系［例數(shù)(%)］Tab 2 The relationship between expression of ILK，MMP-9 in gastric cancer and the clinicopathological parameters［n(%)］

續(xù)表2

2.3 ILK 與MMP-9 表達之間的關(guān)系 80 例胃癌組織中，ILK 和MMP-9 表達均陽性的患者41 例，ILK 陽性、MMP-9 陰性者3 例，ILK 陰性、MMP-9 陽性者12例，兩者均陰性24 例。經(jīng)Spearman 等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織ILK 表達與MMP-9 表達呈顯著正相關(guān)(r=0.553，P ＜0.01，見表3)。

表3 胃癌組織中ILK 與MMP-9 蛋白表達的關(guān)系Tab 3 The relationship between ILK and MMP-9 expressions in gastric cancer

3 討論

ILK 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其N 端具有4 個錨蛋白重復(fù)序列，其下是一個磷酸肌醇結(jié)合基序。PI3K 是在1984 年發(fā)現(xiàn)的一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，其產(chǎn)物包括PIP2 和PIP3 等。PIP3 與ILK 的磷酸肌醇結(jié)合基序結(jié)合后活化，并磷酸化激活PKB/Akt，從而調(diào)節(jié)細胞生長、分化、黏著及侵襲，抑制細胞凋亡，促進細胞增殖［6］。因此ILK 的表達和活性的微小改變，就可能導(dǎo)致人類腫瘤的發(fā)生［7］。ILK 在子宮內(nèi)膜癌［8］、乳腺癌［9］等多種惡性腫瘤中高表達，且表達程度與腫瘤的惡性程度及預(yù)后不良有關(guān)。本研究顯示，ILK 在80例胃癌中陽性率55.0%，顯著高于對照組(P ＜0.05)，且腫瘤浸潤越深，ILK 表達越高;有淋巴結(jié)及大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移組中的ILK 表達分別明顯高于無淋巴結(jié)及大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移組，提示ILK 可能胃癌的發(fā)病密切相關(guān)，并在胃癌的浸潤及轉(zhuǎn)移中起重要作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteniase，MMPs)是鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，它能降解細胞外基質(zhì)所有成分，MMP-9 是MMPs 中降解基底膜最重要的蛋白酶之一，能有效降解細胞基底膜中的Ⅳ、V 膠原和明膠，致使癌細胞突破基底膜向周圍浸潤轉(zhuǎn)移［10］。大量研究表明，MMP-9 在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)過度表達，在惡性腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色［11］。本研究顯示，MMP-9 的高表達與胃癌腫瘤浸潤深度、有無淋巴結(jié)及大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤浸潤越深，MMP-9 表達越高;有淋巴結(jié)及大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移組中的MMP-9 表達分別明顯高于無淋巴結(jié)及大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移組，提示MMP-9 與胃癌的浸潤性生長即發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。與劉紹晨等［12］對胃癌的研究結(jié)果一致，證實MMP-9 過表達者胃癌細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性均升高，提示MMP-9 可作為反映胃癌惡性程度的指標(biāo)之一，用于預(yù)測胃癌患者的預(yù)后。

目前國內(nèi)有關(guān)ILK 和MMP-9 二者在胃癌中關(guān)系的研究未見文獻報道。本研究發(fā)現(xiàn)ILK 與MMP-9 在胃癌組織中的表達呈顯著正相關(guān)(r = 0.553，P ＜0.01)，41 例患者(51.25%)兩者表達均為陽性時，相應(yīng)地出現(xiàn)深度浸潤、高臨床分期和有淋巴結(jié)及大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的機會也大為增加，提示ILK 和MMP-9 在促進胃癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移中可能存在某種時間或空間上的協(xié)同作用，可能的機制為高表達的ILK 誘導(dǎo)MMP-9 表達增加以促進細胞外基質(zhì)和基底膜的降解，從而增強腫瘤細胞的侵襲力，并預(yù)示聯(lián)合檢測兩項指標(biāo)有助于胃癌生物學(xué)行為的判斷和預(yù)后的估計。

［1］ Wu LL，Liang H，Wang XN，et al. The analysis of clinical related factors of recurrence and metastasis of gastric cancer after radical gastrectomy［J］. Chin J Dig，2011，31(1):17-20.吳亮亮，梁寒，王曉娜，等.胃癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移臨床相關(guān)因素分析［J］.中華消化雜志，2011，31(1):17-20.

［2］ Marotta A，Parhar K，Owen D，et al. Characterisation of inten linkedkinase signalling in sporadic human colon cancer［J］. Br J Cancer，2003，88(11):1755-1762.

［3］ Jiang PX，Liu GY，Liang BJ，et al. The expression and diagnostic value of MMP-9 and Snail in osteosarcoma［J］. Chin J Lab Diagn，2012，16(5):916-917.蔣朋翔，劉光耀，梁柏堅，等. MMP-9 和Snail 在骨肉瘤中的表達及其診斷意義［J］.中國實驗診斷學(xué)，2012，16(5):916-917.

［4］ Tan YG，Wang XB，Wang Y，et al. The significance of OPN ＆ MMP-9 in the invasion and metastasis of pancreatic cancer［J］. China Medical Engineering，2011，19(6):60-64.譚永剛，王曉博，王穎，等. OPN、MMP-9 在胰腺癌發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的意義［J］. 中國醫(yī)學(xué)工程，2011，19(6):60-64.

［5］ Wang FL，Huang JB. The expression of ILK and MMP-9 in non-small cell lung cancer［J］.Chin J Misdiagn，2010，10(19):4592-4593.王鳳玲，黃佳濱. ILK 和MMP-9 在非小細胞肺癌中的表達［J］. 中國誤診學(xué)雜志，2010，10(19):4592-4593.

［6］ Peroukides S，Bravou V，Varakis J，et al. ILK over-expression in human hepatocellular carcinoma and liver cirrhosis correlates with activation of Akt［J］. Oncol Rep，2008，20(6):1337-1344.

［7］ Persad S，Attwell S，Gray V，et al. Inhibition of inte grin-linked kinase(ILK)suppresses activation of protein kinase B/Akt and induces cell cycle arrest and apoptosis of PTEN-mutant prostate cancer cells［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(7):3207-3213.

［8］ Li CL，Liu CZ，Li SS，et al. The study of expression and correlation of ilk and estrogenreceptor(er)in en-dometrial carcinoma［J］. Clinical Research，2010，17(9):39-41.李春玲，劉春在，李勝水，等. ILK、ER 在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達及相關(guān)性分析［J］.臨床研究，2010，17(9):39-41.

［9］ Li SS，Xu H，Yu CZ，et al. Clinical significance and expression of ILK in breast neoplasm［J］. China Medical Herald，2009，6(2):32-34.李勝水，許華，于翠珍，等. 乳腺腫瘤中整合素連接激酶(ILK)的表達及臨床意義［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，6(2):32-34.

［10］ Han M，Xu LY，Li EM. Advances in cancer control mechanism of MMP-9 expression［J］. Foreign Medical Sciences(Molecular Biology Section)，2003，25(1):24-26.韓溟，許麗艷，李恩民. 惡性腫瘤中MMP-9 表達調(diào)控機制研究進展［J］.國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊)，2003，25(1):24-26.

［11］ Jia FX，Liu JW，Zhang D，et al. Prognostic value of the expressions of MMP-9 and COX-2 in pancreatic carcinoma［J］. Chin J Clinicians，2011，5(7):1917-1922.賈富鑫，劉江偉，張東，等. MMP-9 和COX-2 蛋白的表達對胰腺癌預(yù)后的影響［J］. 中華臨床醫(yī)師雜志，2011，5(7):1917-1922.

［12］ Liu SC，Xu Q，Qi JM. Research on the correlation between expression of MMP-9 and infiltration and metastasis of gastric carcinoma［J］. Antitumor Pharmacy，2012，2(3):173-176.劉紹晨，許倩，齊潔敏. MMP-9 的表達與胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究［J］. 腫瘤藥學(xué)，2012，2(3):173-176.

［13］ Troussard A，Costello P，Yoganathan TN，et al. The integrin-linked kinase (ILK)induces an invasive phenotype via AP-1 transcription factordependent upregulation of matrix metalloproteinase 9 (MMP-9)［J］. Oncogene，2000，19(48):5444-5452.