王少鑫，浦 江，劉超群，李 超，閆志輝，崔立紅

海軍總醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100048

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種原因不明的慢性非特異性炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年升高的趨勢(shì)，目前認(rèn)為UC 與感染、環(huán)境、免疫以及遺傳等多種因素有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚，有報(bào)道免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中炎癥細(xì)胞因子在UC 的發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用［1］。本研究旨在通過(guò)動(dòng)物模型及人類血清樣本檢測(cè)，進(jìn)一步探討促炎因子IL-6、TNF-α 和抑炎因子IL-4 的表達(dá)在UC 病情進(jìn)展中具有的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床樣本:收集2011 年4 月-2013 年8 月海軍總醫(yī)院門診或住院UC 患者62 例作為研究對(duì)象，男25 例，女37 例，年齡25 ～64 歲，平均年齡(41. 8 ±13.2)歲，入選患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病分會(huì)2007 年制定的UC 診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，并行結(jié)腸鏡檢查。結(jié)合臨床癥狀，將UC 患者分為活動(dòng)期組(44 例)和緩解期組(18 例)，并按疾病的嚴(yán)重程度將患者分為輕度組(16 例)、中度組(17 例)和重度組(11 例)。選取同期健康體驗(yàn)者26 名作為對(duì)照者(對(duì)照組)，男10 例，女16 例，年齡24 ～66 歲，平均年齡(42.68 ±14.2)歲。UC 患者與健康對(duì)照者年齡及性別構(gòu)成相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，具有可比性。所有患者均排除其他腸道感染性疾病、腫瘤、風(fēng)濕及其他自身免疫病。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)海軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象均于清晨抽取靜脈血10 ml，肝素抗凝，4 ℃保存，3 000 r/min，離心10 min，分離血清，-80 ℃凍存待測(cè)。

1.1.2 動(dòng)物組織樣本:選取軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心C57BL/6 雄性小鼠共10 只，周齡6 ～8 周，體質(zhì)量22～24 g 進(jìn)行UC 動(dòng)物模型建立。具體方法:給C57BL/6 雄性小鼠服用2.5%葡聚糖硫酸鈉鹽(dextran sodium sulfate，DSS)飲水，持續(xù)給藥6 d 后處死小鼠，隨后將結(jié)腸組織采用Swiss-roll 的方式翻卷成年輪狀置于10%甲醛中固定，備用于病理學(xué)蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色;同時(shí)取直腸末端及結(jié)腸近端各5 mm 結(jié)腸組織，置于1 ml Trizol 中于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，待行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)(RT-PCR)。

1.2 試劑 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒DRR041A 和PCR 反應(yīng)試劑盒DRR081A 均購(gòu)自TakaRa 公司。IL-6、IL-4 及TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自深圳達(dá)科為公司(DKW12-1040-048，DKW12-1728-048)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 ELISA 檢測(cè):將所有貯存的人血清樣本同一時(shí)間進(jìn)行ELISA 檢測(cè)，操作步驟按照ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2 HE 染色:對(duì)小鼠結(jié)腸炎組織樣本固定24 h 后進(jìn)行石蠟包埋，并3 μm 厚連續(xù)切片，行常規(guī)HE 染色。1.3.3 RT-PCR 檢測(cè):對(duì)UC 動(dòng)物模型直腸末端及結(jié)腸近端組織樣本進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，均按照TakaRa 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用s 表示，多組間比較采用t 檢驗(yàn)或單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠UC 動(dòng)物模型病理組織學(xué)鑒定 小鼠UC模型結(jié)腸組織病理學(xué)HE 染色證實(shí)UC 模型構(gòu)建成功;結(jié)直腸為UC 的好發(fā)部位，可見(jiàn)結(jié)直腸末端黏膜大量剝落，有潰瘍形成，黏膜下組織有大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)，符合UC 病理組織學(xué)表現(xiàn);而結(jié)腸近端結(jié)腸組織黏膜平滑，無(wú)潰瘍形成，黏膜層和黏膜下層均未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，基本屬于正常結(jié)腸組織。因此，病理學(xué)支持結(jié)直腸末端為UC 炎癥組織，而結(jié)腸近端為大致正常結(jié)腸組織(見(jiàn)圖1)。

圖1 UC 小鼠模型(10 ×) A:結(jié)直腸末端為結(jié)腸炎癥組織(200 ×);B:結(jié)腸近端為大致正常結(jié)腸組織(200 ×)Fig 1 UC model (10 ×) A:inflammation tissue in distal colon(200 ×);B:normal tissue in proximal colon (200 ×)

2.2 小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子TNF α、IL-6 和IL-4的mRNA 表達(dá)水平 取小鼠UC 模型結(jié)直腸炎癥組織(結(jié)直腸末端)及結(jié)腸近端組織(大致正常結(jié)腸組織)進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)炎癥組織中IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)水平明顯高于正常組織(P ＜0.05)，分別大約為正常組織的16 倍和70 倍，而IL-4 mRNA 表達(dá)水平明顯低于正常組織(P ＜0.01)，約為正常組織的1/20 倍(見(jiàn)圖2)。

圖2 小鼠UC 模型結(jié)腸炎癥組織與正常組織中TNF-α、IL-6 和IL-4 的mRNA 表達(dá)水平Fig 2 The expressions of TNF-α，IL-6 and IL-4 mRNA in normal and colitis tissue of UC model mice

2.3 UC 患者血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 和IL-4的水平 活動(dòng)期UC 患者血清TNF-α、IL-6 水平均明顯高于對(duì)照組和緩解期組(P ＜0.05)，且升高水平與結(jié)腸炎癥嚴(yán)重程度呈正相關(guān);活動(dòng)期UC 患者IL-4 水平明顯低于對(duì)照組和緩解期組(P ＜0.05)，且降低水平與結(jié)腸炎癥嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。對(duì)照組與緩解期UC 患者的炎癥因子水平相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)表1)。

表1 UC 患者血清TNF-α、IL-6 和IL-4 表達(dá)水平(s)Tab 1 Expression of serum TNF-α，IL-6 and IL-4 in UC patients (s)

表1 UC 患者血清TNF-α、IL-6 和IL-4 表達(dá)水平(s)Tab 1 Expression of serum TNF-α，IL-6 and IL-4 in UC patients (s)

注:與對(duì)照組、緩解期組相比，* P ＜0.05;與對(duì)照組、緩解期組比較，▲P ＜0.01。

例數(shù) IL-6(pg/ml)TNF-α (ng/L)IL-4(pg/ml)26 12.2 ±3.3 5.8 ±1.2 22.8 ±2.6緩解期組 18 16.8 ±4.7 6.9 ±1.8 18.2 ±2.9活動(dòng)期組 44 165.3 ±42.6* 17.6 ±6.4* 6.5 ±1.6*輕度 16 108.2 ±41.2 12.6 ±3.7 8.7 ±1.9中度 17 162.4 ±32.8▲16.9 ±7.8▲ 6.9 ±1.3▲重度 11 222.4 ±56.8▲22.8 ±9.2▲ 4.1 ±0.9對(duì)照組▲

3 討論

近年來(lái)，世界范圍內(nèi)IBD 的發(fā)病率持續(xù)升高，在發(fā)展中國(guó)家尤為明顯。盡管飲食和環(huán)境因素可能影響了IBD 的發(fā)病率，但具體病因和發(fā)病機(jī)制仍不明確。目前，免疫調(diào)節(jié)因素在IBD 發(fā)病中的作用日益受到關(guān)注。IBD 中許多常見(jiàn)的免疫反應(yīng)受炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)，但這些小肽分子的確切致病機(jī)制尚不明確，認(rèn)為在腸黏膜中促炎和抑炎細(xì)胞因子保持平衡對(duì)于腸道生態(tài)平衡的維持是非常重要的［3］，促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1、IL-12、IL-23 等的過(guò)度產(chǎn)生和抑炎因子如IL-4、IL-10、IL-19、IL-22 等生成不足，導(dǎo)致腸道內(nèi)環(huán)境紊亂是促使IBD 發(fā)生的重要環(huán)節(jié)［4］。

TNF-α 是IBD 病理進(jìn)程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，通過(guò)表達(dá)黏附分子、成纖維增殖因子、凝血因子以及啟動(dòng)細(xì)胞毒性、凋亡和急性期反應(yīng)等過(guò)程發(fā)揮作用。TNF-α的血清水平與UC 和克羅恩病(Crohn's disease，CD)的臨床活動(dòng)有關(guān)［5］，抗TNF 抗體廣泛應(yīng)用于IBD 治療并取得良好效果，進(jìn)一步證實(shí)了TNF-α 在結(jié)腸炎癥致病中的關(guān)鍵作用。

IL-6 是一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中啟動(dòng)了細(xì)胞表面信號(hào)復(fù)合體(包括IL-6、sIL-6R 及共享信號(hào)受體gp130)發(fā)揮作用。在UC 發(fā)病機(jī)制及隨后的UC 相關(guān)結(jié)腸癌腫瘤形成中，IL-6 主要通過(guò)STAT3 信號(hào)通路發(fā)揮重要作用［6］。而且Mitsuyama 等［7］發(fā)現(xiàn)sIL-6R 水平在活動(dòng)期UC 和CD 患者較非活動(dòng)性疾病患者中明顯升高，血清IL-6 和sILR 水平與CRP 水平密切相關(guān)?；谶@些數(shù)據(jù)，阻斷IL-6/STAT3 信號(hào)通路以及應(yīng)用IL-6R 抗體很有可能成為未來(lái)充滿希望的治療手段。

IL-4 是一種抗炎因子，通過(guò)刺激B 細(xì)胞和T 細(xì)胞，在結(jié)腸中發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)［8］。IL-4 和IL-10 均能夠通過(guò)下調(diào)炎性介質(zhì)包括TNFα 和IL-1 等，促進(jìn)體液免疫反應(yīng)［9］。在直腸炎中，IL-4 和IL-10 共同作用下能夠逆轉(zhuǎn)Th1/Th2 細(xì)胞活化過(guò)程，進(jìn)而增強(qiáng)Th2 型反應(yīng)，最終改善黏膜修復(fù)。提示在結(jié)腸炎癥進(jìn)展過(guò)程中，抑炎因子IL-4 水平的降低，可能導(dǎo)致了抑炎作用減弱，進(jìn)而加重了結(jié)腸炎癥反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)UC 動(dòng)物模型的構(gòu)建及mRNA 水平的檢測(cè)，表明在動(dòng)物體內(nèi)局部結(jié)腸黏膜促炎癥因子的大量聚集以及抑炎因子的表達(dá)減少可能促進(jìn)了結(jié)腸炎癥的進(jìn)展。而且在人血清標(biāo)本檢測(cè)中也證實(shí)，隨著結(jié)腸炎癥程度的增加，血清中促炎因子和抑炎因子的表達(dá)水平呈相反方向發(fā)展，與病情進(jìn)展相關(guān)，這些結(jié)果均提示抑炎因子和促炎因子的表達(dá)失衡可能在結(jié)腸炎癥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，血清炎癥因子水平檢測(cè)可能成為臨床UC 嚴(yán)重程度的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)臨床診斷和病情監(jiān)測(cè)具有重要的臨床意義。

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