表皮生長因子受體抑制劑吉非替尼對食管癌EC9706細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響

白玉劉尚國1姚文健1趙寶生1

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理教研室，河南新鄉(xiāng)453003)

摘要〔〕目的探討表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑吉非替尼對食管癌EC9706細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。方法將EC9706細(xì)胞培養(yǎng)并加入不同濃度的吉非替尼處理不同時間后，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率；AnnexinV-FITC/PI雙染法、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。PI染色、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。結(jié)果吉非替尼對食管癌EC9706細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且表現(xiàn)為劑量和時間依賴性；吉非替尼組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對照組，且隨著吉非替尼劑量的增加，凋亡率逐漸增加(P<0.05)；與對照組相比，10 μg/ml吉非替尼處理24 h后的EC9706細(xì)胞，處于G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，處于S期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05)。結(jié)論吉非替尼對食管癌EC9706細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，其機(jī)制與誘導(dǎo)凋亡及阻滯細(xì)胞周期有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕吉非替尼；食管癌；增殖；凋亡

中圖分類號〔〕R735.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：河南省衛(wèi)生廳資助課題(200803081)

通訊作者：趙寶生(1966-)，男，主任醫(yī)師，教授，碩士，主要從事食管癌研究。

Doi7Hara F,Aoe M,hara H,et al.Antitumor effect of gefitinib (Iressa) on esophageal squamous cell carcinoma cell lines in vitro and invivo〔J〕.Cancer Lett,2005；226 (1):37-47.

1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科

第一作者：白玉(1981-)，女，講師，碩士，主要從事腫瘤分子病理研究。

分子靶向藥物因其靶點(diǎn)明確、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，正引起人們的廣泛關(guān)注，是目前腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。目前分子靶向藥物的研究主要集中在表皮生長因子受體(EGFR) 上。EGFR為一種相對分子質(zhì)量為170 000 kD的酪氨酸蛋白激酶受體，在多種惡性腫瘤均存在過表達(dá)，其中食管癌EGFR的表達(dá)率高達(dá)40%～70%〔1〕。目前開發(fā)的作用于EGFR的藥物有2種，一種是靶向EGFR胞外域的單克隆抗體，如EGFR阻斷劑西妥昔單抗；一種是靶向受體催化域的EGFR酪氨酸激酶，如酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼。已有研究顯示，吉非替尼對多種惡性腫瘤如肺腺癌細(xì)胞〔2〕、乳腺癌細(xì)胞〔3〕及肝癌細(xì)胞〔4〕等都有顯著抑制作用，但關(guān)于治療食管癌的研究報(bào)道還較少。因此，本實(shí)驗(yàn)擬在細(xì)胞水平上研究吉非替尼對食管癌EC9706細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。

1材料與方法

1.1試劑與儀器吉非替尼(商品名：易瑞沙)為阿斯利康公司產(chǎn)品。食管癌EC9706細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫。四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)染液購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；DNM-9602A酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)；流式細(xì)胞儀及分析軟件(美國BD公司)；其他常用試劑及儀器由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)食管癌EC9706細(xì)胞用含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、濕度85%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天更換培養(yǎng)液并傳代1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2檢測細(xì)胞增殖抑制率用MTT法檢測吉非替尼對EC9706細(xì)胞增殖的抑制作用。吉非替尼用DMSO配置為20 mg/ml的母液，置于-20℃的冰箱中保存。用時常溫解凍后，用RPMI-1640稀釋至所需濃度(DMSO的最終濃度不超過0.1%)。取對數(shù)生長期的EC9706細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，每孔200 μl加入96孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后加入濃度分別為10、20、40、80 μg/ml的吉非替尼。同時設(shè)置調(diào)零組和對照組：分別加入等量完全培養(yǎng)液和含EC9706細(xì)胞的培養(yǎng)液。每組設(shè)5個復(fù)孔，分別孵育12、24 和48 h后，加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞抑制率，抑制率= (1-加藥組OD490值/對照組OD490值)×100%。

1.2.3細(xì)胞凋亡檢測培養(yǎng)收集濃度為10、20、40、80 μg/ml的吉非替尼處理48 h后的EC9706細(xì)胞。對照組設(shè)為不加藥物含EC9706細(xì)胞的培養(yǎng)液。常規(guī)胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，每管細(xì)胞數(shù)達(dá)到1×106個。4℃離心棄上清液，再經(jīng)預(yù)冷的PBS液洗2次，按AnnexinV-FITC/PI試劑盒提供方法用150 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI，輕輕混勻后，避光室溫反應(yīng)15 min，反應(yīng)接受后再加入200 μl結(jié)合緩沖液。流式細(xì)胞儀上樣進(jìn)行檢測。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞周期分析取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成1×106/ml的單細(xì)胞懸液，接種在6孔板培養(yǎng)24 h后，加入10 μg/ml的吉非替尼，對照組設(shè)為不加藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后胰酶消化，離心后棄去上清。用PBS液洗2次，加入70 %冰乙醇固定，4℃過夜。上機(jī)前，離心去乙醇，PBS洗2次。加入1 ml PBS制成細(xì)胞懸液，用100 μl RNaseA消化，37℃水浴30 min。加1 ml PI染液(100 μg/ml)，避光30 min，最后通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，得出細(xì)胞周期的百分率。

2結(jié)果

2.1吉非替尼對食管癌EC9706細(xì)胞增殖的抑制作用與對照組相比，吉非替尼組EC9706 細(xì)胞的生長明顯受到抑制(P<0.05)。隨著藥物濃度提高，EC9706 細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高；當(dāng)藥物濃度固定時，細(xì)胞的增殖抑制率隨著作用時間延長而相應(yīng)升高(P<0.05)。隨著吉非替尼濃度的增大和作用時間的延長，EC9706 細(xì)胞的增殖抑制率也逐漸增加，呈劑量依賴性和時間依賴性。見表1。

2.2吉非替尼對食管癌EC9706細(xì)胞凋亡的影響對照組EC9706細(xì)胞自然凋亡率為1.68%±0.54%，10、20、40、80 μg/ml的吉非替尼作用48 h后細(xì)胞凋亡率分別為18.12%±1.58%、29.54%±1.61%、40.01%±2.14%、51.45%±1.96%，均顯著高于對照組(49.21% vs 63.21%,P<0.05)。各組隨著吉非替尼劑量的增加，凋亡率逐漸增加(34.11% vs 22.87%,P<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例無明顯差異(16.68% vs 13.92%，P>0.05)。

表1吉非替尼對食管癌EC9706細(xì)胞增殖的抑制作用(%)

吉非替尼濃度(μg/ml)12h24h48h對照組0001018.21)27.81)2)38.41)2)2022.41)36.71)2)51.61)2)4039.51)47.51)2)64.61)2)8046.81)61.81)2)71.21)2)

與前一濃度組比較：1)P<0.05;與前一時間點(diǎn)比較：2)P<0.05

2.3吉非替尼對食管癌EC9706細(xì)胞周期的影響與對照組相比，經(jīng)10 μg/ml的吉非替尼作用24 h后的EC9706細(xì)胞，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加(49.21% vs 63.21%,P<0.05)；S期細(xì)胞比例明顯減少(34.11% vs 22.87%,P<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例無明顯差異(16.68% vs 13.92%,P>0.05)。

3討論

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿，大多數(shù)病例確診時已是晚期，雖然隨著外科手術(shù)的進(jìn)步和早期診斷水平的提高，食管癌的治療取得了不少進(jìn)展，但患者5年生存率仍不足20%，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及化療耐藥是影響生存率的主要原因〔5〕。目前臨床急需一種新型的高效安全的食管癌治療途徑。

現(xiàn)在許多學(xué)者開始積極探索靶向藥物治療，針對不同細(xì)胞表面分子的新型靶向藥物不斷涌現(xiàn)，其中作用于EGFR的靶向藥物是最為重要的一類。EGFR是表皮生長因子受體家族成員之一，主要參與細(xì)胞的增殖、生長、遷移、浸潤與存活。EGFR信號通路的異常與腫瘤的惡性表型、正常細(xì)胞凋亡的抑制、血管生成以及腫瘤的轉(zhuǎn)移都密切相關(guān)〔6〕。EGFR的生物特性提示它能成為抗癌治療的有效靶點(diǎn)。而70%以上的食管癌中存在EGFR表達(dá)或過表達(dá)〔7〕。吉非替尼是EGFR酪氨酸激酶抑制劑，其作用機(jī)制是與ATP 競爭性的結(jié)合EGFR 的酪氨酸激酶胞內(nèi)區(qū)位點(diǎn)，抑制EGFR跨膜細(xì)胞表面受體上酪氨酸激酶的自身磷酸化，從而阻止細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡〔8〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果指示EC9706 細(xì)胞對吉非替尼有著較強(qiáng)的敏感性，吉非替尼能明顯抑制EC9706細(xì)胞的增殖。吉非替尼對EC9706細(xì)胞具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用，并且隨著吉非替尼劑量的增加，凋亡率逐漸增加。細(xì)胞周期分析顯示吉非替尼能使G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加。G0期為停止細(xì)胞分裂的靜止期，G1期為DNA合成前期，吉非替尼能使細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，從而抑制了細(xì)胞的有絲分裂，起到遏制癌細(xì)胞增殖和擴(kuò)散的作用。

4參考文獻(xiàn)

1何向明.分子靶點(diǎn)藥物治療食管癌的臨床研究進(jìn)展〔J〕.中國腫瘤,2009；18(2):300-3.

2王亞麗,牟曉燕,游力,等.吉非替尼對肺腺癌細(xì)胞增殖和表皮生長因子受體表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2010；30(6):805-8.

3李曉莉,姜明哲.吉非替尼對人乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響〔J〕.中國腫瘤,2010；19(4):270-4.

4魏超,周乃珍,郭慧,等.不同序貫的吉非替尼與化療藥物聯(lián)合對人肝癌細(xì)胞Bel-7402增殖的抑制作用〔J〕.安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào),2011；12(3):265-8.

5Mariette C,Finzi L,Fabre S,etal.Factors predictive of complete resection of operable esophageal cancer:a prospective study〔J〕.Ann Thorac Surg,2003；75(5)：1720-6.

6唐炳華,王繼峰.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)〔M〕.北京:中國中醫(yī)藥出版社,2007：146-7.

8張小玉,鐘國成,李宏斌.分子靶向治療在食管癌的應(yīng)用進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué),2009；35(4):243-5.

〔2013-06-07修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)