三七三醇皂苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠微管相關蛋白2、膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達的影響

張利軍白宇侯育青程記偉陳黎佶

(上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,上海200062)

摘要〔〕目的了解局灶性腦缺血再灌注后梗死區(qū)周圍微管相關蛋白(MPA)2、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達的動態(tài)變化以及三七三醇皂苷對其表達的影響。方法采用改良的線栓法制備大腦中動脈阻塞0.45 h后，不同再灌注時間(1、7、14、21、28 d) ，大鼠短暫局灶性腦缺血模型。應用免疫雙標法觀察再灌注損傷后1、7、14、21、28 d Brdu、Brdu/MPA2 、Brdu/GFAP表達及三七三醇皂苷對其影響。結(jié)果腦缺血再灌注后14 d Brdu表達水平達到峰值,至再灌注28 d Brdu表達水平已明顯回落,但仍較正常水平高。再灌注7、14、21 d,三七三醇皂苷組Brdu/GFAP陽性細胞比例高于模型組(P<0.05)。三七三醇皂苷組Brdu/MPA2陽性細胞水平于整個實驗過程中均較相同時間段對照組增多，但都無顯著差異(P>0.05) 。結(jié)論腦缺血再灌注后神經(jīng)干細胞增殖水平增高，而三七三醇皂苷治療可能加速了神經(jīng)干細胞的增殖，并可能使增殖的神經(jīng)干細胞更多向膠質(zhì)細胞分化。

關鍵詞〔〕三七三醇皂苷; 腦缺血再灌注; Brdu;微管相關蛋白(MPA)2;膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)

中圖分類號〔〕R743.3〔

基金項目：上海市教委基金資助項目(No.08CZ039)

第一作者：張利軍(1971-)，男，碩士，碩士生導師，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管疾病研究。

三七三醇皂苷(PTS) 主要活性成分人參三醇皂苷Rg1 的含量達60%以上,Rg1、R1、Re 三者的含量約達80%。在研究三七中人參三醇皂苷對腦缺血的保護作用時發(fā)現(xiàn)PTS可通過抑制腦血管通透性的增加，減輕腦水腫，使得神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、小血管及毛細血管周圍間隙輕度增寬，神經(jīng)細胞腫脹明顯減輕，有利于神經(jīng)細胞的修復〔1〕。本實驗觀察不同時期梗死區(qū)周圍皮層5-溴脫氧尿嘧(Brdu)、Brdu/微管相關蛋白(MPA)2、Brdu/膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達情況，識別缺血再灌注損傷后增殖細胞的來源和分化情況及PTS對其的影響。

1材料與方法

1.1動物模型制備及分組健康雄性SD 大鼠,體重250～300 g ,由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。7%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，采用改良Longa線栓法阻塞大鼠大腦中動脈，建立急性局部腦缺血模型。45 min后，將尼龍線輕柔拉回致頸外動脈處，即為再灌注開始。將尼龍線僅留在頸內(nèi)動脈而不入顱，45 min后，將尼龍線拉回致頸外動脈處，為假手術組。動物隨機分為:①PTS (成都華神集團股份有限公司制藥廠)組(PTS 50 mg·kg-1·d-1);②模型組(0.9%氯化鈉1 mg·kg-1·d-1)③假手術組。每組又分造模后第1、7、14、21、28天共5個時間組,其中PTS組、模型組每個時間組各5 只,假手術組各4只。

1.2PTS及Brdu給藥PTS 組大鼠于再灌注術后按50 mg/kg 腹腔注射給藥,每天1次,直至取材;模型組大鼠,藥物由生理鹽水代替; 各組大鼠達規(guī)定時限前1 d,腹腔注射Brdu(50 mg/kg,Sigma公司)2次,間隔3 h ,最后1 次注射后24 h 大鼠在麻醉下,斷頭取腦。

1.3免疫雙標染色嚴格按照操作步驟固定、取材、切片、封片，-20℃保存待共聚焦觀察各組皮層Brdu、Brdu+MPA2、Brdu+GFAP陽性表達。

1.4圖像分析切片在統(tǒng)一放大倍數(shù)(10×10) 下,于梗死區(qū)周圍皮層隨機選3個視野,測量方式選全視場測量,使用上海求為生物科技有限公司MIQAS醫(yī)學圖像免疫組化定量分析軟件自動分析檢測出熒光圖像中陽性區(qū)域面積和陽性比率。

1.5統(tǒng)計學方法采用PEMS軟件進行方差分析,兩兩比較用SNK-q檢驗。

2結(jié)果

2.1腦缺血再灌注后梗死區(qū)周圍皮層Brdu陽性細胞比較假手術組Brdu 陽性標記物為圓形、卵圓形或橢圓形、呈亮藍色、境界清晰，主要分布在室管膜、室管膜下區(qū)及海馬齒狀回且數(shù)目少、分散。PTS組及模型組缺血再灌注1 d,Brdu陽性細胞開始增多,于缺血中心區(qū)及缺血周邊皮層、海馬呈散落分布，PTS組與模型組間無明顯差異(P>0.05)。PTS組與模型組缺血周邊皮層于再灌注7、14 d,均可見Brdu陽性細胞數(shù)目急劇增多并達高峰,至21 d時增長幅度下降,尤以模型組明顯。在缺血再灌注第7、14、21、28天時,PTS組與模型組間Brdu陽性細胞數(shù)有顯著差異(P<0.05)。見表1。

表1　腦缺血再灌注后梗死區(qū)周圍皮層Brdu陽性細胞變化

與模型組比較：1)P<0.05；下表同

2.2免疫雙標染色觀察GFAP、MPA2表達免疫雙標染色: 整個實驗過程中假手術組僅有少量Brdu/GFAP陽性標記細胞，模型組和PTS 組梗死區(qū)周圍皮層可見較多Brdu/GFAP陽性標記細胞分布,Brdu/GFAP陽性為藍色加紅色熒光(圖1)。再灌注1 d時模型組和PTS組即可見梗死區(qū)周圍皮層Brdu/GFAP陽性細胞,明顯多于假手術組(P<0.05)，但模型組和PTS組相比無明顯差異(P>0.05)。再灌注7 d時,Brdu/GFAP陽性細胞明顯增多,再灌注14 d時Brdu/GFAP陽性細胞數(shù)目達頂峰(圖1),圍繞梗死區(qū)皮層散在分布，且模型組和PTS 組相比Brdu/GFAP陽性細胞差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此后，隨Brdu陽性細胞數(shù)目逐漸回落,Brdu/GFAP陽性細胞數(shù)目亦有所減少,至再灌注28 d時,Brdu/GFAP陽性細胞數(shù)已明顯回落。 在整個實驗過程中，盡管PTS組在缺血再灌注第1、7、14、21、28天各時間點Brdu/MPA2陽性細胞數(shù)均比模型組多，且有隨再灌注時間延長逐漸增趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

圖1　PTS組及模型組再灌注14 d梗死區(qū)周圍Brdu/GFAP 陽性表達(免疫雙標法，×100)

組別nBrdu/GFAP1d7d14d21d28dBrdu/MPA21d7d14d21d28dPTS組52.2465.8488.221)7.491)3.9982.1982.8083.7563.3183.192模型組52.0524.6126.4065.773.3221.7442.312.9442.6542.742假手術組40.82751.051.06750.8650.86251.00511.2551.00251.0475

3討論

腦缺血損傷時損傷側(cè)的海馬、室管膜、大腦皮質(zhì)和健側(cè)海馬區(qū)域的神經(jīng)干細胞(NSC)增殖、遷移和分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，以試圖代償和修復損傷的神經(jīng)組織〔2,3〕。Brdu陽性細胞可被看作具有增殖活性的細胞〔4〕。但由于腦梗死所致的血腦屏障破壞及動物模型制作過程中的手術損傷刺激均可以引起腦內(nèi)炎性細胞增殖,因此腦梗死后增殖的細胞既有炎性細胞也有神經(jīng)前體細胞。NSC具有自我復制和多向分化(神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞)的潛能〔5〕，MPA2在成熟的神經(jīng)元中有較高的表達水平，近年來被認為是神經(jīng)元身份鑒定的特異性抗原之一。 GFAP是星形膠質(zhì)細胞特異性抗原標志。因此應用Brdu/MPA2、Brdu/GFAP 免疫雙標記法可確定增殖細胞的來源及神經(jīng)干/前體細胞的數(shù)目和分布情況。

研究顯示，PTS可減少缺血再灌注大鼠腦組織Nogo-A mRNA和蛋白表達、減少Caspase-3表達、抑制腦缺血再灌注后炎癥因子分泌及細胞凋亡，從而起到腦保護作用〔6～8〕。已有研究顯示反應性星形膠質(zhì)細胞增生與維持腦損傷后內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、促進血管再生、神經(jīng)生長、有利于可塑性修復作用發(fā)生〔9〕,同時,活性星形膠質(zhì)細胞釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子,是促進神經(jīng)細胞再生的最有效的因子,作為神經(jīng)細胞生長調(diào)節(jié)信號可以調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞構筑、存活及可塑性變化,誘導合成增加,提供軸索合成基質(zhì),參與內(nèi)源性修復,以促進中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)軸索的生長和存活,在神經(jīng)細胞再生過程中起相當重要的作用。室管膜下區(qū)的NSC正常情況下是相對靜止的,誘導或刺激其發(fā)生增殖、分化的因素中,基礎成纖維細胞的作用尤為令人注目,基礎成纖維細胞作為刺激NSC 增殖的重要的絲裂原,可以誘導相對靜止的神經(jīng)干細胞進入細胞周期，若將基礎成纖維細胞注入成年鼠的側(cè)腦室內(nèi),則可促進NSC增殖及新生細胞數(shù)量的增加〔10,11〕。本研究推測腦缺血再灌注后神經(jīng)元再生比較困難，而PTS治療可能加速了NSC的增殖，并可能使增值的NSC更多向膠質(zhì)細胞分化，其機制有待進一步研究。另外在缺血中心區(qū)亦有散在分布的增殖細胞,但此類細胞并無Brdu/MPA2、Brdu/GFAP陽性標記,推測可能是侵入的炎性細胞。

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〔2013-09-13修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)