CKS1 siRNA對人舌癌Tca8113細胞中CKS1蛋白的抑制作用

徐亞娟孫旭1李爍烯2段秀梅2李樹蕾1劉文書2

(吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林長春130012)

摘要〔〕目的探討CKS1 siRNA對人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞中CKS1蛋白的干擾作用。方法設計特異性CKS1插入序列，轉(zhuǎn)入Tca8113細胞，應用免疫組化、RT-PCR、Western印跡檢測Tca8113細胞中CKS1蛋白的表達。結(jié)果CKS1 siRNA成功導入并抑制了Tca8113細胞中CKS1蛋白的表達(P<0.05)。結(jié)論CKS1 siRNA能抑制Tca8113細胞中CKS1蛋白的表達，應用CKS1 siRNA治療舌癌具有可行性。

關(guān)鍵詞〔〕CKS1 siRNA；Tca8113細胞；免疫組化；反義RNA ；CKS1蛋白

中圖分類號〔〕R739〔

基金項目：吉林省發(fā)展和改革委員會資助項目(JF2012C006-8)

通訊作者：劉文書(1966-)，男，副教授，碩士生導師，主要從事頜面部腫瘤基礎和臨床研究。

1吉林大學臨床醫(yī)學院2吉林大學第一醫(yī)院

第一作者：徐亞娟(1965-)，女，主任醫(yī)師，主要從事頜面部腫瘤的臨床研究。

CKS1蛋白在惡性腫瘤中的表達增高，可通過對泛素化蛋白的降解，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔1〕。siRNA可與核糖核酸酶復合物結(jié)合形成由RNA誘導的基因沉默復合體，引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默〔2〕。本實驗前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)舌癌中的CKS1蛋白在舌癌中高表達，本研究旨在進一步探討其應用于舌癌基因治療的可能性。

1材料與方法

1.1材料人舌癌細胞Tca8113購自北京博楓科生物科技有限公司。小鼠抗人CKS1抗體、RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；SP試劑盒、DAB試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；DMEM培養(yǎng)基(美國，Gibco)、胎牛血清(以色列)購自沃特司公司；siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海GenePharma公司；RAPI裂解液、BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RT-PCR試劑盒購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。所用引物由上海生工生物公司合成。

1.2CKS1 siRNA轉(zhuǎn)染根據(jù)GenBank中CKS1 mRNA全序列，在Reyn-okls設計原則基礎上，選取針對編碼區(qū)的兩端序列作為RNA干擾靶序列，使用Ambion在線設計軟件設計并選取基因特異性插入片段序列。設計引物：5′-UGGAGGAAUCUUGGCGUUCUUTT-3′ (有意義鏈)，5′-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3 (對照鏈)，將siRNA序列進行2′Ome修飾和5′FAM修飾。體外培養(yǎng)細胞至2.5×104個/ml，并提前1 d將細胞接種在24孔板中，待細胞的匯合度在30%～50%采用siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染試劑盒將CKS1 siRNA導入Tca8113細胞(嚴格按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行)。37℃，CO2培養(yǎng)箱孵育48 h后倒置顯微鏡下，采用同一個視野相同放大倍數(shù)進行普通光源和熒光觀察并拍照，共檢測三張不同爬片，檢測3個不同的視野。在合成圖像中計數(shù)綠色熒光細胞，計算轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率=(綠色熒光細胞/總細胞數(shù))×100%。

1.3CKS1干擾效率檢測

1.3.1轉(zhuǎn)染前后的免疫細胞組織化學染色檢測將轉(zhuǎn)染前后的Tca8113分別接種于蓋玻片表面，待細胞達到70%匯合時，用4%多聚甲醛固定，然后采用免疫組織化學方法對CKS1蛋白標記(按抗體說明書進行)，以PBS液代替一抗作為陰性對照。最后用DAB顯色，蘇木精復染，顯微鏡下觀察。每張圖片測量3個不同的視野，每組檢測3張不同的細胞爬片，用軟件IPP6.0分析平均光密度。

1.3.2轉(zhuǎn)染前后的RT-PCR檢測用Trizol提取轉(zhuǎn)染前后Tca8113細胞中的總RNA，根據(jù)NCBI-GenBank中公布的CKS1基因全序列確定擴增目的基因片段。根據(jù)引物設計原則，應用Primer 5.0軟件設計引物：CKS1-正義：5′-CCCACTACCCAAGAAACCAA-3′，CKS1-反義：5′-CCGCAAGTCACCACACATAC-3′； 利用RT-PCR試劑盒進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，CKS1的PCR產(chǎn)物為406 bp。圖像經(jīng)Image J軟件分析灰度值，進行半定量分析，各組之間的比較以相差2倍上認定為有顯著性差異。

1.3.3轉(zhuǎn)染前后Western印跡檢測用含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RAPI裂解液提取Tca8113細胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測蛋白濃度(按試劑盒說明書操作)，調(diào)整蛋白濃度使之一致，等量的蛋白質(zhì)經(jīng)變性后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，最后采用Western印跡和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)法檢測蛋白。圖像經(jīng)Image J軟件分析灰度值，進行半定量分析，各組之間的比較以相差2倍以上認定為有顯著性差異。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS11.0進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1CKS1 siRNA轉(zhuǎn)染前后的Tca8113細胞表達 轉(zhuǎn)染前Tca8113細胞呈上皮樣，有突起，胞質(zhì)清亮，可見居中的細胞核及明顯的核仁，細胞生長狀態(tài)良好(圖1A)。在熒光顯微鏡下，CKS1 siRNA轉(zhuǎn)染后的Tca8113細胞胞體較大，突起明顯減少(圖1B)；同一個視野相同放大倍數(shù)條件下的熒光觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的Tca8113細胞的熒光強度明顯增強(圖1C)。CKS1 siRNA的轉(zhuǎn)染率通過合成圖像中綠色熒光細胞的數(shù)量來計算(圖1D)，轉(zhuǎn)染效率=綠色熒光細胞/總細胞數(shù)×100%=95%符合實驗要求。

圖1　CKS1 siRNA轉(zhuǎn)染前后Tca8113細胞的表達

2.2轉(zhuǎn)染前后的細胞免疫組織化學染色轉(zhuǎn)染前Tca8113細胞質(zhì)內(nèi)CKS1蛋白表達豐富，灰度值為52 521 700±7 163.689 5。轉(zhuǎn)染后細胞質(zhì)內(nèi)CKS1表達明顯減少，灰度值35 201 480±9 052.124，轉(zhuǎn)染前后比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2　轉(zhuǎn)染前后CKS1在 Tca8113細胞中的表達

2.3轉(zhuǎn)染前后的RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染CKS1 siRNA組的CKS1 mRNA表達明顯低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。見表1，圖3。

-：空白對照組；N：陰性對照組； CKS1：轉(zhuǎn)染siRNA組；下圖同 圖3　RT-PCR檢測CKS1 mRNA表達

組別β-actinCKS1CKS1/β-actin空白對照組56.491±4.89241.176±2.151)4.271)陰性對照組45.918±5.22291.068±1.721)6.331)轉(zhuǎn)染siRNA組41.78±3.965.661±0.390.14

與轉(zhuǎn)染siRNA組比較：1)P<0.05，下表同

2.4轉(zhuǎn)染前后Western印跡檢測轉(zhuǎn)染48 h后細胞中CKS1蛋白明顯減少，與空白對照組和陰性對照組相比差異顯著(P<0.05)，提示CKS1蛋白質(zhì)的合成受阻，但尚有部分CKS1存在。見表2，圖4。

圖4　Western印跡檢測CKS1蛋白表達

組別GAPDHCKS1空白對照組15869.985±14.115299.45±25.031)陰性對照組15170.902±10.344492.23±15.581)轉(zhuǎn)染siRNA組16211.425±18.952246.32±14.52

3討論

CKS1基因位于人染色體8q21，其相對分子量為9×103，全長有717 bp序列，其中240 bp堿基有編碼作用，可編碼79個氨基酸〔3〕；是高度保守的Sucl/CKS的家族成員，可通過結(jié)合其他周期蛋白依賴性激酶或磷酸化的蛋白調(diào)控細胞周期，在細胞有絲分裂過程中，特別是G1期和M期尤為重要〔4〕。 CKS1在很多癌組織中異常表達，陳紹發(fā)〔5〕在研究肝癌中發(fā)現(xiàn)，CKS1在肝組織中表達增高，明顯高于癌旁組織，且隨著臨床病理分級的升高，其表達出現(xiàn)明顯的增高。趙勇等〔6〕檢測了直腸癌組織中的CKS1蛋白的表達，結(jié)果其在癌組織中獲得了高表達且與腫瘤的分化程度相關(guān)。Slotky等〔7〕在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，CKS1的表達水平隨著腫瘤的惡性程度和年齡的增長而增高，且與術(shù)后復發(fā)有關(guān)。本研究表明轉(zhuǎn)染CKS1 siRNA能有效降解細胞內(nèi)的CKS1 mRNA，進而降低CKS1蛋白在舌癌中的表達。因此，將CKS1 siRNA用于舌癌的靶向治療，可為臨床治療舌癌提供新的思路和方法。

4參考文獻

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2房寶英.siRNA及其導入體內(nèi)外方法的研究進展〔J〕.國際病理科學與臨床雜志，2006;27(1):44-7.

3陳紫萱，黃如欣，張忠英.Cks1蛋白在惡性腫瘤中的研究進展〔J〕.檢驗醫(yī)學與臨床,2009;6(9):705-6.

4Tsai YS，Chang HC，Chuang LY，etal.RNA silencing of Cks1 induced G2/M arret and apoptosis in human lung cancer cells〔J〕.IUBMB Life，2005;57(8):583-9.

5陳紹發(fā).Cks1和CyclinD1在老年肝細胞癌中的表達〔J〕.中國老年學雜志，2013;9(33):4556-7.

6趙勇，高建飛，章必成，等.結(jié)直腸癌中Cks1、p27kip1和 Skp2蛋白的表達〔J〕.第四軍醫(yī)大學學報，2006;27(2)：168-9.

7Slotky M，Shapira M，Izhak OB，etal.The expression of the ubiquitin ligase subunit Cks1 in human breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res，2005;7(5):737-44.

〔2013-11-03修回〕

(編輯徐杰)