高壓氧對老年大鼠脊髓損傷后巨噬細胞極化和神經(jīng)保護的影響

耿承奎曹紅花1熊鷹余化霖2

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院骨科，云南昆明650051)

摘要〔〕目的探討脊髓損傷(SCI)后高壓氧治療(HBOT)的效果，尤其對老年大鼠巨噬細胞活化和神經(jīng)保護的影響。方法建立脊髓鉗夾損傷動物模型。大鼠隨機分為假手術(shù)組，常壓空氣治療組〔NBA組，21%氧氣、1個標準大氣壓(ATA)〕，HBOT組(100%氧氣，2.8 TAT)，90 min/次，2次/d，共3 d。分別檢測三組模型的巨噬細胞活化、細胞凋亡、組織防護和功能恢復(fù)情況。 結(jié)果SCI環(huán)境下HBOT帶來顯著性變化，M2亞型的數(shù)量和水平顯著提升，M1亞型的數(shù)量下降。這與同步發(fā)生的髓過氧化物酶(MPO)活性的衰減、致炎因素〔如白介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-17〕的下調(diào)有關(guān)。堅牢藍(LFB)和GAP-43染色結(jié)果顯示，HBOT組的髓鞘形成和軸突再生的水平明顯高于NBA組。 結(jié)論HOBT可以提升M2亞型巨噬細胞活性，有效地減少SCI相關(guān)炎癥的發(fā)生，這可能促進神經(jīng)保護并有助于老年大鼠SCI后的功能恢復(fù)。

關(guān)鍵詞〔〕脊髓損傷；高壓氧治療； 繼發(fā)性損傷； 巨噬細胞極化

中圖分類號〔〕R459.6〔

基金項目：云南省聯(lián)合基金(2008CD006)；云南省教育廳基金(2011y184)

通訊作者：余化霖(1963-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事微創(chuàng)神經(jīng)外科臨床研究。

1云南省腫瘤醫(yī)院血液科

2昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院微創(chuàng)神經(jīng)外科

第一作者：耿承奎(1980-)，男，在讀博士，主治醫(yī)師，主要從事脊髓損傷修復(fù)研究。

脊髓損傷(SCI)會導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)損傷，治療費用昂貴，且需要長期護理〔1〕。巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞是主要的炎性細胞，巨噬細胞包括兩種亞型，M1亞型可產(chǎn)生高水平氧化代謝產(chǎn)物和促炎細胞因子，是機體主要的防御體系，并具有腫瘤細胞殺傷功能，但這也容易造成對健康細胞和組織的附帶損害；M2亞型促進血管生成和基質(zhì)重塑，同時破壞免疫抑制功能〔2〕。高壓氧治療(HBOT)可促進受損組織的愈合，減少炎癥反應(yīng)，使組織含氧水平提高10～15倍以促進毛細血管生成〔3〕。本研究旨在探討SCI后HBOT的效果，尤其對老年大鼠巨噬細胞活化和神經(jīng)保護的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物分組SD大鼠(體重250～300 g)由昆明醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。按不同的治療方法分為假手術(shù)組、常壓空氣治療組〔NBA組，1個標準大氣壓(TAT)下21%氧氣〕、HBOT組(2.8 ATA下100%氧氣)，每組28只。

1.2SCI模型腹腔內(nèi)注射(0.3 ml)戊巴比妥鈉和阿托品1∶1混合物麻醉大鼠。在整個手術(shù)過程中，大鼠體溫保持在38℃。在T9～T10椎骨行椎板切開術(shù)，暴露T11脊髓節(jié)段并用微血管夾(BS4 61-0196，25 g閉合力)夾閉10 s。然后取下夾子，縫合肌肉和皮膚層。手術(shù)后，皮下注射5～10 ml生理鹽水防止大鼠脫水。將動物置于溫暖的籠子里過夜，并給予充足的水和食物。每天給大鼠手工協(xié)助排尿兩次，直到大鼠恢復(fù)膀胱反射。對假手術(shù)組大鼠只進行椎板切除術(shù)。

1.3HBOT治療過程在鋼質(zhì)動物高壓氧艙中，初始充入100%氧氣。艙內(nèi)壓力隨后在10 min內(nèi)增加到2.8 ATA，并在治療過程結(jié)束后5 min內(nèi)逐漸減壓到常壓。每次均在手術(shù)后立即進行HBOT，時間均為90 min，2次/d，持續(xù)3 d。艙內(nèi)保持22℃～26℃和15 L/min氧氣流量。

1.4功能評估采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)量表。該量表對功能行為特定部分，如肢體運動、爪安置/位置、步伐、協(xié)同、腳趾間隙和尾巴位置進行分析，總分21分。

1.5樣本收集在SCI后指定的時間點對大鼠以水合氯醛(500 mg/kg)和4%多聚甲醛PBS溶液心內(nèi)灌注。脊髓病灶中間2 cm的區(qū)域被切掉后，浸泡在同一固定液內(nèi)過夜；然后放在30%蔗糖PBS溶液內(nèi)48 h，用恒冷切片機(賽默飛世爾科技公司提供)切成10 μm厚的橫向(第3、7、14天共三組脊髓樣品)或矢向(第3天脊髓樣品)段。每連續(xù)切完100 μm厚的脊髓樣品時收集一次切片樣品。

從已處死大鼠解剖出一段0.5 mm的脊髓中心樣品，并用冷裂解緩沖液處理，使用組織勻漿器(Tissue Tearor985370，美國俄克拉荷馬州巴特爾斯Biospec公司提供)在冰上勻漿。4℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液快速冷凍，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.6巨噬細胞極化將冰凍切片以含0.3%Triton X-100的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.6)進行透化處理。使用的一抗是小鼠抗精氨酸-1 多克隆抗體(1∶200， 英國劍橋Abcam公司提供)，大鼠抗CD16/32(1∶200， Abcam公司提供)和山羊抗CD206(1∶200， 美國加利福尼亞州圣克魯斯生物技術(shù)公司提供)；小鼠抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)(1∶200，Abcam公司提供)。細胞核用DAPI進行復(fù)染。所有免疫細胞化學(xué)實驗操作均重復(fù)三次。

1.7髓過氧化物酶(MPO)活性在SCI后第3、7、14天(n=5)，將超聲處理后的勻漿物以13 000 r/min和4℃條件下離心15 min，然后將上清液移至新的離心管中，加入含鄰聯(lián)茴香胺二鹽酸化物的磷酸鉀緩沖液(pH6.0)和過氧化氫，用分光光度計(SPECTRA MAX 190，美國加利福尼亞州桑尼韋爾分子儀器設(shè)備公司提供)以460 nm吸光度進行測量。MPO活性定義為在37℃環(huán)境下，每分鐘消耗1 mmol過氧化物的酶的量，表示為在濕潤組織中的毫克單位。

1.8細胞因子的表達水平在SCI后的第3、7、14天，部分脊髓組織的勻漿液混以2 mmol/L的苯甲基磺酰氟(意大利米蘭西格瑪化學(xué)公司提供)保存在PBS中，測量的細胞因子包括腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細胞介素(IL)-1β和IL-17。按照使用說明，用比色商業(yè)試劑盒(美國加利福尼亞州圣迭戈加州生化-諾瓦生化集團公司提供)進行測定。

1.9神經(jīng)保護使用勒克斯堅牢藍(LFB)染色測定SCI后第7、28天殘存的包繞神經(jīng)軸突外的髓鞘。每只大鼠的3～5個冠狀切片在95%乙醇中脫水并直接浸泡在37℃環(huán)境下的LFB(含有95%乙醇)中過夜以進行LFB染色。以蒸餾水沖洗掉多余的染色劑后，再以95%乙醇沖洗。隨后，將切片在0.05%碳酸鋰溶液中浸泡4 min后，再在70%乙醇中浸泡4 min以區(qū)分各切片。用蒸餾水沖洗后，將切片再在95%乙醇中區(qū)分5 min，接著用100%乙醇清洗2次，每次5 min。然后，將切片在脫蠟劑(美國喬治亞州亞特蘭大國家診斷中心提供)里漂洗兩次，用

Permount(Fisher)覆蓋，操作結(jié)束。外側(cè)索的LFB陽性區(qū)域用彩色影像分析儀(日本福井縣三谷MacSCOPE公司提供)在光強自動設(shè)定、400倍放大倍數(shù)下測定顆粒計數(shù)。

2結(jié)果

2.1功能分析在SCI之前，所有的動物運動功能均正常(BBB=21± 0)。假手術(shù)組，所有的動物在損傷后1 d就恢復(fù)到BBB 21分。從SCI后第7天起，兩個實驗組的運動能力逐漸提高。比較而言，在第14、21、28天時，HBOT組的大鼠表現(xiàn)出更高的得分(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

與NBA組比較：1)P<0.01,2)P<0.05，下圖同 圖1　BBB運動功能評分(BBB)

2.2巨噬細胞極化HBOT組的iNOS巨噬細胞數(shù)量減少，損傷后第3～14天差異最為明顯。損傷后第3天進行的矢狀位Arg-1(M2亞型)免疫染色反應(yīng)發(fā)現(xiàn)NBA組的創(chuàng)面中心集中少量的陽性細胞；而HBOT組的病損處周圍集中較多的Arg-1陽性細胞。強大的Arg-1免疫產(chǎn)物主要集中于陽性細胞的細胞質(zhì)。HBOT組在損傷后第14天，M2型巨噬細胞得到促進而M1型巨噬細胞被抑制。

2.3發(fā)炎反應(yīng)與假手術(shù)組相比，NBA組(P<0.001)和HBOT組(P<0.001)在損傷后第7天，受傷的脊髓節(jié)段(T11)的MPO活性顯著升高；然而與NBA組相比，HBOT組明顯抑制了MPO的活性增加(P<0.05)。在損傷7 d后，IL-1β、TNF-α 和IL-17水平大幅增加。與NBA組相比，HBOT組的IL-1β(P<0.01)、TNF-α(P<0.05)和IL-17(P<0.01)水平得到明顯的抑制。見圖2。

A：假手術(shù)組；B：NBA組；C：HBOT組 圖2　假手術(shù)組、NBA組和HBOT組在損傷后第7天的發(fā)炎反應(yīng)

2.4神經(jīng)保護在損傷后第42天，HBOT組的備用髓鞘明顯面積高于NBA組。在損傷后第7、28天，可以在HBOT組觀察到一個較大的GAP-43陽性區(qū)(圖3)。

圖3　HBOT對神經(jīng)備用髓鞘的影響(LFB染色，×400)

3討論

HBOT經(jīng)常應(yīng)用于創(chuàng)傷的早期治療，取得了顯著的效果。近年的研究表明，HBOT可以提高SCI后的神經(jīng)功能和日?；顒?，且療效明顯〔3〕。HBOT可以增加血液的含氧量，提高氧的擴散距離，擴張小動脈，改善局部微循環(huán)，減輕受傷部位水腫和脊髓周圍的缺血/缺氧。這些好處歸因于對損傷部位神經(jīng)元的保護及消除周圍神經(jīng)元繼發(fā)性損傷〔4〕。本研究提供了新的證據(jù)，表明HBOT避免了繼發(fā)性損傷帶來的傷害，同時通過激活M2型巨噬細胞、抑制細胞凋亡提供神經(jīng)保護而促進功能恢復(fù)。

事實上，早期研究表明SCI后巨噬細胞反應(yīng)在繼發(fā)性損傷的發(fā)展中起著積極而重要的作用。經(jīng)典活化巨噬細胞(M1亞型)是脊髓損傷后出現(xiàn)的主要類型，這對受損組織有不良影響，包括抑制軸突生長和誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡；然而替代性活化巨噬細胞(M2亞型)則與之相反，可以促進神經(jīng)軸突再生、新血管的生長和細胞外基質(zhì)沉積〔5〕。SCI后沒有功能恢復(fù)，部分原因也許是M1亞型的發(fā)生率超過了M2亞型。其他研究也顯示，iNOS是損傷后的急性期內(nèi)經(jīng)典活化途徑表達上升而出現(xiàn)的第一種M1亞型標志〔2，6〕。在此我們發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生致炎性細胞因子的iNOS陽性巨噬細胞群(M1亞型)，主要集中在脊髓損傷后損傷部位及周圍組織。然而，HBOT減少了脊髓損傷后的急性期內(nèi)病損部位的iNOS陽性巨噬細胞群。這一發(fā)現(xiàn)與以前的報告相似，Huang等〔6〕發(fā)現(xiàn)，相比于SCI組，SCI+HBOT組的脊髓中信使RNA(mRNA)和iNOS的蛋白質(zhì)表達顯著減少。另一方面，Arg-1是替代性活化途徑和M2亞型巨噬細胞的早期指示因子。我們的數(shù)據(jù)表明，HBOT對創(chuàng)面中心的Arg1陽性巨噬細胞群(M2亞型)有促進作用；這一結(jié)果表明，HBOT可以有效促進M2巨噬細胞形成。此外，HBOT組的功能恢復(fù)開始于損傷后第7天，這也是M2水平峰值出現(xiàn)的時間?？梢酝茢啵琀BOT組中SCI后功能恢復(fù)的部分原因是M2的神經(jīng)保護作用。

以前的研究已經(jīng)證實了SCI后HBOT的其他積極作用，這與我們的研究一致。Yang等〔7〕表明，HBOT減少了SCI誘導(dǎo)的脊髓水腫，穩(wěn)定血脊髓屏障，并通過下調(diào)IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表達以及上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達促進神經(jīng)功能的恢復(fù)。Dayan等〔8〕通過比較SCI對照組發(fā)現(xiàn)，HBOT治療可以降低脊髓組織酶〔超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)

和一氧化氮(NO)〕的水平。我們的研究表明由于M2巨噬細胞的活化，在損傷后第28天觀察到LFB染色陽性率有所增加，表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)保護作用，這可能是抑制炎性級聯(lián)反應(yīng)而帶來的神經(jīng)元存活增加的結(jié)果。此外，相比于對照組，HBOT治療提高了SCI后第14天運動功能BBB評分，意味著相對于先前的治療方案，現(xiàn)在的研究從解剖學(xué)上的回復(fù)得到明顯提高。Yang等〔7〕也發(fā)現(xiàn)，HBOT干預(yù)可以通過下調(diào)HMGB1/NF-κB減少由于炎癥反應(yīng)造成的繼發(fā)性損傷并促進神經(jīng)功能修復(fù)。在此我們發(fā)現(xiàn)，HBOT顯著降低了半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-9和B淋巴細胞瘤(bcl)-2基因的表達,并且并降低了SCI相關(guān)炎癥的發(fā)展。先前的證據(jù)顯示，IL-1β和TNF-α在環(huán)氧合酶-2〔9〕和活性氧(ROS)的誘導(dǎo)功能中發(fā)揮著重要的作用，這是眾所周知的造成SCI后繼發(fā)性神經(jīng)元損傷的原因。本研究進一步證實，HBOT通過減少IL-1β、IL-17和TNF-α的產(chǎn)生顯著降低了脊髓受損大鼠的TUNEL陽性細胞數(shù)量，這與以前的研究結(jié)果一致。

綜上所述，HBOT促進了M2巨噬細胞的形成，且有效地減少了SCI相關(guān)炎癥的發(fā)展，這可能會進一步抑制細胞凋亡，并有助于大鼠SCI后的功能恢復(fù)。

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〔2013-05-11修回〕

(編輯徐杰)