四氫吡咯二硫代氨基甲酯對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模擬缺血再灌注誘導(dǎo)炎癥因子的影響

曾敏吳智勇鄭茵何揚(yáng)利費(fèi)毅劉肖君

(海南省人民醫(yī)院，海南海口570311)

摘要〔〕目的通過(guò)四氫吡咯二硫代氨基甲酯(PDTC)研究核因子(NF)-κB對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECS)模擬缺血再灌注后炎癥因子表達(dá)的影響。 方法分為五組對(duì)HUVECs進(jìn)行培養(yǎng)，即對(duì)照組(正常培養(yǎng)基培養(yǎng))、缺血再灌注組(模擬缺血培養(yǎng)液培養(yǎng)30 min后換正常培養(yǎng)液再培養(yǎng)4 h)、缺血再灌注+0.1 mmol/L PDTC組、缺血再灌注+0.25 mmol/L PDTC組和缺血再灌注+0.5 mmol/L PDTC組。后三組均于模擬缺血再灌注培養(yǎng)前1 h在培養(yǎng)液中添加相應(yīng)濃度PDTC。實(shí)時(shí)定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測(cè)不同濃度PDTC對(duì)腫瘤壞死因子(TNF)-α、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。 結(jié)果模擬缺血再灌注刺激TNF-α、ICAM-1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,P<0.01)。同時(shí)，模擬缺血再灌注刺激HUVECS上清液TNF-α和ICAM-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。0.1、0.25、0.5 mmol/L PDTC均顯著降低模擬缺血再灌注所誘導(dǎo)的TNF-α和ICAM-1 的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。0.5 mmol/L PDTC顯著降低模擬缺血再灌注所誘導(dǎo)的TNF-α和ICAM-1 的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)DTC通過(guò)沉默p65，抑制模擬缺血再灌注誘導(dǎo)的TNF-α和ICAM-1表達(dá)水平。

關(guān)鍵詞〔〕四氫吡咯硫代氨基甲酯；模擬缺血再灌注；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕Q291〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)

第一作者：曾敏(1975-)，女，博士，主任醫(yī)師, 主要從事冠心病方面的研究。

The effect of PDTC on the expression of pro-inflammatory factors under the condition of mimic ischemia/reperfusion in human umbilical vein endothelial cells

ZENG Min, WU Zhi-Yong, ZHENG Yin,etal.

The People's Hospital of Hainan Province, Haikou 570311, Hainan, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the regulation mechanism of pro-inflammatory after mimic ischemia/reperfusion (I/R)culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) with the utilization of PDTC.MethodsHUVECs were divided into control (culture with normal media), mimic I/R (mimic ischemic media cultured for 30 min followed by normal media cultured for 4 h), mimic I/R group+0.1 mmol/L PDTC, mimic I/R group +0.25 mmol/L PDTC and mimic I/R group + 0.5 mmol/L PDTC groups. For the latter 3 groups, HUVECs were treated with PDTC 1 h before mimic I/R. The expressions of TNF-αand ICAM-1 mRNA and protein as well as cell survival were determined by real-time PCR and ELISA assay, respectively.ResultsThe mRNA levels of TNF-α(P<0.05) and ICAM-1(P<0.01) were significantly increased by mimic I/R. Meanwhile, the protein levels of TNF-αand ICAM-1 were all significantly increased by mimic I/R (P<0.05). 0.1, 0.25, 0.5 mmol/L PDTC significantly decreased mRNA levels of TNF-αand ICAM-1 (P<0.05)。0.5 mmol/L PDTC significantly suppressed supernatant TNF-αand ICAM-1 protein levels (P<0.05).ConclusionsPDTC inhibited mimic I/R - induced expressions of TNF-α和ICAM-1.

【Key words】PDTC; Mimic ischemic/reperfusion; Human umbilical vein endothelial cells

炎癥反應(yīng)是參與缺血再灌注損傷的重要機(jī)制〔1〕。本研究通過(guò)體外模擬缺血再灌注培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，探討缺血再灌注對(duì)炎癥因子表達(dá)水平的影響，以及轉(zhuǎn)錄因子核因子(NF)-κB如何通過(guò)下游分子腫瘤壞死因子(TNF)-α、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1調(diào)控細(xì)胞缺血再灌注損傷。

1材料與方法

1.1材料和試劑HUVEC(購(gòu)自ATCC)，并采用添加了內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)物、5%胎牛血清和青/鏈霉素的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)(購(gòu)自美國(guó)科學(xué)細(xì)胞研究實(shí)驗(yàn)室)。四氫吡咯二硫代氨基甲酯(PDTC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。 Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)； ScriptTM cDNA 合成試劑盒(BIO-RAD公司)；SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa公司)；CXCL16 ELISA試劑盒 (美國(guó)R&D Systems公司)。鼠抗人NF-κB p65抗體和鼠抗人β-actin抗體(美國(guó)Santa cruz公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將HUVEC 細(xì)胞復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶,加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2條件下孵箱內(nèi)培養(yǎng),5～7 d 傳代1次,采用0.25% 胰蛋白酶消化細(xì)胞。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組分為正常對(duì)照組：正常內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；缺血再灌注組(模擬缺血培養(yǎng)液培養(yǎng)30 min后換正常培養(yǎng)液再培養(yǎng)4 h)；缺血再灌注+0.1 mmol/L PDTC組(模擬缺血再灌注培養(yǎng)前1 h加0.1 mmol/L PDTC)；缺血再灌注+0.25 mmol/L PDTC組(模擬缺血再灌注培養(yǎng)前1 h加0.25 mmol/L PDTC)；缺血再灌注+0.5 mmol/L PDTC組(模擬缺血再灌注培養(yǎng)前1 h加0.5 mmol/L PDTC)。

1.3HUVEC細(xì)胞模擬缺血再灌注培養(yǎng)〔2〕將HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)在包含118 mmol/L氯化鈉,24 mmol/L碳酸氫鈉,1.0 mmol/L磷酸鈉,2.5 mmol/L氯化鈣,1.2 mmol/L氯化鎂,20 mmol/L乳酸鈉,16 mmol/L氯化鉀,10 mmol/L 2-脫氧葡萄糖(pH調(diào)至6.2)的“缺血液”中30 min，然后換為再灌注液即正常培養(yǎng)基進(jìn)行再灌注4 h。

1.4實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)TNF-α和ICAM-1用Trizol 試劑盒(Invitrogen公司) 抽提細(xì)胞總RNA。定量逆轉(zhuǎn)錄PCR使用ScriptTM cDNA 合成試劑盒。18S rRNA作為內(nèi)對(duì)照。實(shí)時(shí)定量采用SYBR Premix Ex Taq和iQ5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(BioRad)。TNF-α引物，正義:5′-CCTGTGAGGAGGACGAACAT-3′，反義:5′-AGGCCCCAGTTTGAATTCTT-3′；ICAM-1引物，正義:5′-CAGAGGTTGAACCCCACAGT-3′，反義:5′- CCTCTGGCTTCGTCAGAATC-3′；18S rRNA引物正義:5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′，反義:5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3′(引物均由北京三博遠(yuǎn)志公司合成)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):mRNA樣品1 μg，iScript 逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl,5倍 iScript 反應(yīng)混合物4 μl，加無(wú)RNase 的雙蒸水至20 μl ,輕輕振蕩混勻,25℃溫育5 min ,42℃溫?zé)?0 min,85℃加熱5 min。實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng):cDNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl ,正、反義引物各0.4 μl,SYBR預(yù)混劑10 μl(寶生物 DRR041A),焦碳酸二乙酯(DEPC)水(Sigma 公司)7.2 μl。反應(yīng)條件:第一步95℃ 30 s；第二步95℃ 5 s，62℃ 30 s,運(yùn)行40個(gè)循環(huán)；第三步55℃ 15 s，運(yùn)行81個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本3孔,取3 批實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.5Western印跡檢測(cè)NF-κB p65蛋白表達(dá)水平細(xì)胞蛋白樣品用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加人一抗即鼠抗人NF-κB p65多克隆抗體(1∶200)，鼠抗人β-actin抗體(1∶500)，4℃過(guò)夜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠二抗(1∶10 000，中國(guó)中杉金橋公司)，室溫1 h。TBST洗膜3次，加入顯色底物硝基藍(lán)四唑(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP)避光顯色。以Image J分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度對(duì)比分析。將目的蛋白NF-κB p65條帶的灰度與內(nèi)參蛋白β-actin條帶的灰度相比，以消除上樣量差異的影響，對(duì)比各組樣本蛋白表達(dá)水平的變化情況。

1.6酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)法(ELISA)測(cè)定TNF-α、ICAM-1可溶性蛋白收集各種實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)HUVECs的上清液，以1 000 r/min離心5 min后再取上清于-80℃低溫凍存。采用美國(guó)R&D公司生產(chǎn)的TNF-α、ICAM-1檢測(cè)試劑盒,應(yīng)用雙抗體夾心ELISA測(cè)定標(biāo)本中TNF-α、ICAM-1水平,與其他相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TNF-α、ICAM-1含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),計(jì)算樣品濃度。

2結(jié)果

2.1各組NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較模擬缺血再灌注刺激HUVECs NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著升高，達(dá)對(duì)照組的3.81倍(P<0.01)。作為NF-κB的特異性抑制劑，0.1、0.25、0.5 mmol/L PDTC均顯著降低模擬缺血再灌注所誘導(dǎo)的NF-κB p65蛋白表達(dá)水平(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

2.2各組TNF-α和ICAM-1的mRNA 表達(dá)水平比較模擬缺血再灌注刺激TNF-α、ICAM-1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,P<0.01)。0.1、0.25、0.5 mmol/L PDTC均顯著低于模擬缺血再灌注所誘導(dǎo)的TNF-α mRNA表達(dá)水平(P<0.01)。同時(shí)，均顯著低于模擬缺血再灌注所誘導(dǎo)的ICAM-1的 mRNA表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表1。

A：對(duì)照組；B：缺血再灌注組；C:缺血再灌注+0.1 mmol/L PDTC組；D:缺血再灌注+0.25 mmol/L PDTC組；E:缺血再灌注+0.5 mmol/L PDTC組；與缺血再灌注組比較：1)P<0.01 圖1　各組NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較

組別TNF-αICAM-1正常對(duì)照組11.15±0.793.26±0.74缺血再灌注組19.73±1.212)12.04±0.831)缺血再灌注+0.1mmol/LPDTC組5.42±0.463)3.44±0.293)缺血再灌注+0.25mmol/LPDTC組5.70±0.803)4.03±0.754)缺血再灌注+0.5mmol/LPDTC組4.62±0.193)2.69±0.153)

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與缺血再灌注組比較：3)P<0.01，4)P<0.05

2.3ELISA檢測(cè)各組上清液TNF-α和ICAM-1蛋白表達(dá)水平模擬缺血再灌注刺激HUVECs上清液TNF-α和ICAM-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。0.5 mmol/L PDTC顯著低于模擬缺血再灌注所誘導(dǎo)的TNF-α和ICAM-1 的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。見(jiàn)表2 。

表2　各組上清液TNF-α和ICAM-1

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05；與缺血再灌注組比較：2)P<0.05

3討論

眾多證據(jù)表明,細(xì)胞因子參與了許多心血管疾病的病理過(guò)程〔3〕。在慢性充血性心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、心臟術(shù)后內(nèi)皮損傷以及心肌再灌注損傷等研究中證實(shí),TNF-α和ICAM-1作為致炎細(xì)胞因子表達(dá)大量增加〔4～6〕。但是，心肌缺血再灌注時(shí)細(xì)胞因子如TNF-α、ICAM-1等升高的具體機(jī)制仍不十分清楚。

前期研究顯示，NF-κB在內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷機(jī)制中起重要作用〔2〕。NF-κB是Rel 蛋白家族成員,通常以p65/p50二聚體形式存在。靜息狀態(tài)下,NF-κB與κB抑制蛋白結(jié)合形成三聚體存在于細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞受到刺激后,通過(guò)信號(hào)傳遞,κB抑制蛋白從p65/p50/κB抑制蛋白三聚體上解離,p65/p50移位進(jìn)入細(xì)胞核,與相應(yīng)的DNA位點(diǎn)結(jié)合,啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄〔7〕。Shakhov等〔8〕提示NF-κB對(duì)TNF-α的生成起重要作用。本研究與此一致。在心肌缺血再灌注損傷中，血管內(nèi)皮細(xì)胞首先受到刺激，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)NF-κB被激活，參與了ICAM以及促炎細(xì)胞因子如TNF-α、ICAM-1等表達(dá)的調(diào)控，使這些因子表達(dá)增高，造成組織損傷，而且此過(guò)程中產(chǎn)生的TNF-α又是NF-κB的強(qiáng)誘導(dǎo)劑〔9〕，能進(jìn)一步激活NF-κB，形成惡性循環(huán)加重再灌注損傷的程度。對(duì)大鼠腸缺血再灌注后的研究中〔10〕也發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后白細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，NF-κB和ICAM-1表達(dá)增高，在缺血再灌注損傷中起著重要作用。NF-κB介導(dǎo)的黏附分子的異常表達(dá)是再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)。Chen等〔11〕研究顯示，蛋白酶體抑制劑硼替佐米可通過(guò)抑制NF-κB活化來(lái)減少I(mǎi)CAM-1、TNF-α等炎癥因子的高表達(dá)，能有效減輕細(xì)胞再灌注損傷。正常情況下,淋巴細(xì)胞功能相關(guān)性抗原(LFA)-1與ICAM-1 的黏附能力很弱,粒細(xì)胞不能發(fā)揮其作用。但是在各種刺激下,細(xì)胞釋放的TNF-α等細(xì)胞因子可以促進(jìn)ICAM-1等黏附分子的表達(dá),這些黏附分子進(jìn)一步增強(qiáng)粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,引發(fā)微循環(huán)障礙,加之粒細(xì)胞的破壞作用,從而協(xié)同促進(jìn)組織臟器的再灌注損傷〔12〕。本實(shí)驗(yàn)提示缺血再灌注中NF-κB可能通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶基因TNF-α和ICAM-1 mRNA轉(zhuǎn)錄而最終影響該炎癥因子的蛋白表達(dá)水平，產(chǎn)生相應(yīng)的病理生理作用。

綜上,轉(zhuǎn)錄因子NF-κB誘導(dǎo)細(xì)胞因子TNF-α和ICAM-1的高表達(dá)，介導(dǎo)缺血再灌注損傷中的炎癥反應(yīng)。通過(guò)PDTC抑制缺血再灌注過(guò)程中TNF-α和ICAM-1的表達(dá)和釋放將有助于炎癥反應(yīng)的改善,進(jìn)而減輕再灌注損傷。研究提示以NF-κB 作為干預(yù)靶點(diǎn)來(lái)預(yù)防和治療再灌注具有很大潛力，但是尚需要更多的基礎(chǔ)及臨床實(shí)驗(yàn)為NF-κB 在再灌注治療中的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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〔2013-12-24修回〕

(編輯袁左鳴)